ইমিউন’মডুলেটৰী মেটাবলাইট টিউমাৰ মাইক্ৰ’এনভাইৰনমেণ্ট (TME)ৰ এটা মূল বৈশিষ্ট্য, কিন্তু কেইটামান ব্যতিক্ৰম বাদ দি, ইহঁতৰ পৰিচয় বহুলাংশে অজ্ঞাত হৈ আছে। ইয়াত আমি উচ্চ গ্ৰেডৰ চেৰাছ কাৰ্চিনোমা (HGSC) ৰোগীৰ টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ পৰা টিউমাৰ আৰু টি কোষ বিশ্লেষণ কৰি এই বিভিন্ন টিএমই বিভাগৰ মেটাব’ল’ম উন্মোচন কৰিলোঁ। জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰ কোষৰ বিপাকীয় পদাৰ্থৰ বিস্তৃত পাৰ্থক্য আছে। জলসিঞ্চনৰ তুলনাত টিউমাৰত অনুপ্ৰৱেশকাৰী টি কোষবোৰ ১-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA) দ্বাৰা যথেষ্ট সমৃদ্ধ। যদিও টি কোষত এম এন এৰ মাত্ৰা বৃদ্ধি পায়, তথাপিও নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্ৰেন্সফেৰেজ (এছ-এডিন’চাইলমিথিঅ’নিনৰ পৰা নিকোটিনামাইডলৈ মিথাইল গোটৰ স্থানান্তৰ অনুঘটক হিচাপে কাম কৰা এনজাইম)ৰ প্ৰকাশ ফাইব্ৰ’ব্লাষ্ট আৰু টিউমাৰ কোষত সীমাবদ্ধ থাকে। কাৰ্য্যক্ষমভাৱে এম এন এয়ে টি কোষক টিউমাৰ প্ৰসাৰিত কৰা চাইট’কাইন টিউমাৰ নেক্ৰচিছ ফ্যাক্টৰ আলফা নিঃসৰণ কৰিবলৈ প্ৰৰোচিত কৰে। গতিকে টি এম ইৰ পৰা আহৰণ কৰা এম এন এয়ে টি কোষৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা নিয়ন্ত্ৰণত অৰিহণা যোগায় আৰু মানৱ কৰ্কট ৰোগৰ চিকিৎসাৰ বাবে সম্ভাৱ্য ইমিউন’থেৰাপি লক্ষ্যক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে।
টিউমাৰৰ পৰা আহৰণ কৰা বিপাকীয় পদাৰ্থই এন্টি-টিউমাৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতাত গভীৰ প্ৰতিৰোধক প্ৰভাৱ পেলাব পাৰে আৰু অধিক আৰু অধিক প্ৰমাণে দেখুৱাইছে যে ই ৰোগৰ অগ্ৰগতিৰ বাবেও এটা মূল চালিকা শক্তি হিচাপে কাম কৰিব পাৰে (১)। ৱাৰবাৰ্গ প্ৰভাৱৰ উপৰিও টিউমাৰ কোষৰ বিপাকীয় অৱস্থা আৰু টিউমাৰৰ মাইক্ৰ’এনভাইৰনমেণ্ট (TME)ৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতাৰ অৱস্থাৰ সৈতে ইয়াৰ সম্পৰ্কৰ বৈশিষ্ট্য নিৰ্ণয়ৰ বাবে শেহতীয়াকৈ কাম আৰম্ভ হৈছে। মাউছৰ মডেল আৰু মানুহৰ টি কোষৰ ওপৰত কৰা অধ্যয়নত দেখা গৈছে যে গ্লুটামাইন বিপাকীয় ক্ৰিয়া (২), অক্সিডেটিভ বিপাকীয় ক্ৰিয়া (৩) আৰু গ্লুক’জ বিপাকীয় ক্ৰিয়া (৪) বিভিন্ন প্ৰতিৰোধ কোষ উপগোটৰ ওপৰত স্বতন্ত্ৰভাৱে কাম কৰিব পাৰে। এই পথসমূহত থকা কেইবাটাও বিপাকীয় পদাৰ্থই টি কোষৰ এণ্টি টিউমাৰ কাৰ্য্যত বাধা দিয়ে। প্ৰমাণিত হৈছে যে কোএনজাইম টেট্ৰাহাইড্ৰ’বায়’পটেৰিন (BH4)ৰ অৱৰোধে টি কোষৰ প্ৰসাৰত ক্ষতি কৰিব পাৰে, আৰু শৰীৰত BH4 বৃদ্ধিয়ে চিডি৪ আৰু চিডি৮ৰ মধ্যস্থতাত এণ্টি-টিউমাৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি কৰিব পাৰে। ইয়াৰ উপৰিও বি এইচ ৪ প্ৰয়োগ কৰিলে কিনুৰেনিনৰ ইমিউন’চাপ্ৰেচিভ প্ৰভাৱ উদ্ধাৰ কৰিব পাৰি (৫)। আইছ'চাইট্ৰেট ডিহাইড্ৰ'জেনেজ (IDH) মিউটেণ্ট গ্লিঅ'ব্লাষ্টোমাত এনান্টিঅ'মেটাবলিক (R)-2-হাইড্ৰক্সিগ্লুটাৰেট (R-2-HG)ৰ নিঃসৰণে টি কোষ সক্ৰিয়কৰণ, প্ৰসাৰ আৰু চাইট'লাইছিছ কাৰ্য্যকলাপত বাধা দিয়ে (6)। শেহতীয়াকৈ দেখা গৈছে যে গ্লাইকোলাইছিছৰ উপ-উৎপাদন মিথাইলগ্লাইঅক্সেল মাইল’ইড উৎপত্তিৰ দমনকাৰী কোষৰ দ্বাৰা উৎপন্ন হয় আৰু মিথাইলগ্লাইঅক্সেলৰ টি কোষ স্থানান্তৰে ইফেক্টৰ টি কোষৰ কাৰ্য্যকলাপত বাধা দিব পাৰে। চিকিৎসাত মিথাইলগ্লাইঅক্সেলৰ নিষ্ক্ৰিয়কৰণে মাইল’ইড-উত্পন্ন চাপ্ৰেছৰ কোষ (MDSC)ৰ কাৰ্য্যকলাপ অতিক্ৰম কৰিব পাৰে আৰু মাউছ মডেলত চেকপইণ্ট ব্লকড থেৰাপীক সহযোগিতামূলকভাৱে বৃদ্ধি কৰিব পাৰে (7)। এই অধ্যয়নসমূহে সামূহিকভাৱে টি কোষৰ কাৰ্য্য আৰু কাৰ্য্যকলাপ নিয়ন্ত্ৰণ কৰাত টিএমই-উত্পন্ন বিপাকীয় পদাৰ্থৰ মূল ভূমিকাক গুৰুত্ব আৰোপ কৰে।
ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগত টি কোষৰ বিসংগতিৰ বিষয়ে বহুলভাৱে ৰিপৰ্ট কৰা হৈছে (৮)। ইয়াৰ কাৰণ আংশিকভাৱে হাইপ’ক্সিয়া আৰু অস্বাভাৱিক টিউমাৰৰ ভেছকুলেচৰ (9)ৰ অন্তৰ্নিহিত বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য, যাৰ ফলত গ্লুক’জ আৰু ট্ৰিপ্ট’ফেনক লেক্টিক এচিড আৰু কিনুৰেনিনৰ দৰে উপ-উৎপাদনলৈ ৰূপান্তৰিত হয়। অত্যধিক বহিঃকোষীয় লেক্টেটে ইন্টাৰফেৰন-γ (IFN-γ) উৎপাদন হ্ৰাস কৰে আৰু মাইলোচাপ্ৰেচিভ উপগোটৰ পাৰ্থক্যক ড্ৰাইভ কৰে (10, 11)। ট্ৰিপ্ট’ফেনৰ ব্যৱহাৰে টি কোষৰ প্ৰসাৰক প্ৰত্যক্ষভাৱে বাধা দিয়ে আৰু টি কোষৰ ৰিচেপ্টৰ সংকেত প্ৰদানত বাধা দিয়ে (১২-১৪)। এই পৰ্যবেক্ষণসমূহৰ পিছতো, প্ৰতিৰোধ বিপাকীয় ক্ৰিয়াক কেন্দ্ৰ কৰি বহু কাম অনুকূলিত মাধ্যম ব্যৱহাৰ কৰি ইন ভিট্ৰ' টি কোষ সংস্কৃতিত কৰা হৈছিল, বা ইন ভিভ'ত সমৰূপী মাউছ মডেলত সীমাবদ্ধ কৰা হৈছিল, যিবোৰৰ কোনোটোৱেই মানৱ কৰ্কট ৰোগ আৰু শাৰীৰিক বৃহৎ আৰু মাইক্ৰ' পৰিৱেশৰ বৈষম্য সম্পূৰ্ণৰূপে প্ৰতিফলিত নকৰে।
ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ এটা সাধাৰণ বৈশিষ্ট্য হ’ল পেৰিটনিয়াল বিস্তাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ আৱিৰ্ভাৱ। জলসিঞ্চিত কোষৰ তৰল পদাৰ্থ জমা হোৱাটো উন্নত ৰোগ আৰু দুৰ্বল পূৰ্বাভাসৰ সৈতে জড়িত (১৫)। প্ৰতিবেদন অনুসৰি এই অনন্য বিভাগটো হাইপ’ক্সিক, ইয়াত ভেছকুলাৰ এণ্ড’থেলিয়াল গ্ৰ’থ ফ্যাক্টৰ (VEGF) আৰু ইণ্ড’লিয়ামিন ২,৩-ডাইঅক্সিজেনেজ (IDO)ৰ মাত্ৰা অধিক থাকে, আৰু ইয়াত টি নিয়ন্ত্ৰক কোষ আৰু মাইল’ইড প্ৰতিৰোধক কোষে অনুপ্ৰৱেশ কৰে (১৫-১৮)। জলসিঞ্চনৰ বিপাকীয় পৰিৱেশ টিউমাৰৰ পৰা পৃথক হ’ব পাৰে, গতিকে পেৰিটনিয়াল স্থানত টি কোষৰ পুনৰ প্ৰগ্ৰেমিং অস্পষ্ট। ইয়াৰ উপৰিও টিউমাৰৰ পৰিৱেশত উপস্থিত জলসিঞ্চন আৰু বিপাকীয় পদাৰ্থৰ মাজত থকা মূল পাৰ্থক্য আৰু বৈষম্যই ৰোগ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা কোষৰ অনুপ্ৰৱেশ আৰু টিউমাৰত ইয়াৰ কাৰ্য্যত বাধাৰ সৃষ্টি কৰিব পাৰে আৰু অধিক গৱেষণাৰ প্ৰয়োজন।
এই সমস্যাসমূহ সমাধানৰ বাবে আমি বিভিন্ন কোষ প্ৰকাৰ (চিডি৪ + আৰু চিডি৮ + টি কোষকে ধৰি) লগতে টিউমাৰৰ ভিতৰত আৰু মাজত অধ্যয়ন কৰিবলৈ সংবেদনশীল কোষ পৃথকীকৰণ আৰু তৰল ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী টেণ্ডেম মাছ স্পেকট্ৰ’মেট্ৰি (এলচি-এমএছ/এমএছ) পদ্ধতিৰ ডিজাইন কৰিলোঁ। আমি এই পদ্ধতিটো উচ্চ-মাত্ৰিক ফ্ল' চাইট'মেট্ৰি আৰু একক-কোষীয় আৰ এন এ ক্ৰমবিন্যাস (scRNA-seq)ৰ সৈতে সংগতি ৰাখি এই মূল জনসংখ্যাসমূহৰ বিপাকীয় অৱস্থাৰ এক অতি সমাধান কৰা প্ৰতিকৃতি প্ৰদান কৰোঁ। এই পদ্ধতিত টিউমাৰ টি কোষত ১-মিথাইলনিকোটিনামাইড (MNA)ৰ মাত্ৰা যথেষ্ট বৃদ্ধি পোৱা দেখা গৈছিল আৰু ইন ভিট্ৰ’ পৰীক্ষাত দেখা গৈছিল যে টি কোষৰ কাৰ্য্যত এম এন এৰ ইমিউন’মডুলেটৰী প্ৰভাৱ পূৰ্বতে অজ্ঞাত আছিল। সাধাৰণতে এই পদ্ধতিয়ে টিউমাৰ আৰু ইমিউন কোষৰ মাজৰ পাৰস্পৰিক বিপাকীয় পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া উন্মোচন কৰে, আৰু ইমিউন নিয়ন্ত্ৰণ বিপাকীয় পদাৰ্থৰ বিষয়ে অনন্য অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে, যিবোৰ টি কোষ ভিত্তিক ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ চিকিৎসাৰ বাবে উপযোগী হ’ব পাৰে ইমিউন’থেৰাপি চিকিৎসাৰ সুযোগ।
গ্লুক'জ গ্ৰহণৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰিবলৈ আমি একেলগে উচ্চ মাত্ৰাৰ ফ্ল' চাইট'মেট্ৰি ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) আৰু মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল কাৰ্য্যকলাপ [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) কাষে কাষে সাধাৰণ ইমিউন কোষ আৰু টিউমাৰ কোষৰ জনসংখ্যাক পৃথক কৰা মাৰ্কাৰ (তালিকা S2 আৰু চিত্ৰ S1A)। এই বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে টি কোষৰ তুলনাত জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰ কোষত গ্লুক’জ গ্ৰহণৰ মাত্ৰা বেছি, কিন্তু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপৰ পাৰ্থক্য কম। টিউমাৰ কোষৰ গড় গ্লুক’জ গ্ৰহণ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] টি কোষৰ তুলনাত তিনিৰ পৰা চাৰিগুণ, আৰু CD4 + T কোষৰ গড় গ্লুক’জ গ্ৰহণ CD8 + T কোষৰ ১.২ গুণ, যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে একেটা টিএমইতো টিউমাৰ অনুপ্ৰৱেশকাৰী লিম্ফোচাইট (TIL)ৰ বিপাকীয় প্ৰয়োজনীয়তা বেলেগ বেলেগ (চিত্ৰ ১A)। ইয়াৰ বিপৰীতে টিউমাৰ কোষত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ CD4 + T কোষৰ দৰেই আৰু দুয়োবিধ কোষৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ CD8 + T কোষতকৈ বেছি (চিত্ৰ ১B)। সাধাৰণতে এই ফলাফলসমূহে বিপাকীয় স্তৰ উন্মোচন কৰে। টিউমাৰ কোষৰ বিপাকীয় কাৰ্য্যকলাপ CD4 + T কোষতকৈ বেছি, আৰু CD4 + T কোষৰ বিপাকীয় কাৰ্য্যকলাপ CD8 + T কোষতকৈ বেছি। কোষৰ প্ৰকাৰৰ মাজত এই প্ৰভাৱৰ সত্ত্বেও টিউমাৰৰ তুলনাত জলসিঞ্চনত CD4 + আৰু CD8 + T কোষৰ বিপাকীয় অৱস্থা বা ইয়াৰ আপেক্ষিক অনুপাতত কোনো সামঞ্জস্যপূৰ্ণ পাৰ্থক্য দেখা নাযায় (চিত্ৰ ১C)। ইয়াৰ বিপৰীতে CD45-কোষৰ অংশত টিউমাৰত EpCAM+ কোষৰ অনুপাত জলসিঞ্চনৰ তুলনাত বৃদ্ধি পায় (চিত্ৰ ১D)। আমি EpCAM+ আৰু EpCAM- কোষৰ উপাদানৰ মাজত স্পষ্ট বিপাকীয় পাৰ্থক্যও পৰ্যবেক্ষণ কৰিলোঁ। EpCAM+ (টিউমাৰ) কোষৰ গ্লুক’জ গ্ৰহণ আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ EpCAM- কোষতকৈ বেছি, যিটো TME ৰ টিউমাৰ কোষত ফাইব্ৰ’ব্লাষ্টৰ বিপাকীয় কাৰ্য্যকলাপতকৈ বহু বেছি (চিত্ৰ ১, ই আৰু এফ)।
(A আৰু B) গ্লুক'জ গ্ৰহণৰ মধ্যম প্ৰতিসৰণ তীব্ৰতা (MFI) (2-NBDG) (A) আৰু CD4 + T কোষৰ মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল কাৰ্য্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় ৰঙা) (B) প্ৰতিনিধিত্বমূলক গ্ৰাফ (বাওঁফালে) আৰু টেবুলত নিৰ্মিত তথ্য (সোঁফালে), CD8 + T কোষ আৰু EpCAM + CD45-টিউমাৰ কোষৰ জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ পৰা। (C) জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত CD4 + আৰু CD8 + কোষৰ (CD3 + T কোষৰ) অনুপাত। (D) জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত EpCAM + টিউমাৰ কোষৰ অনুপাত (CD45−)। (E আৰু F) EpCAM + CD45-টিউমাৰ আৰু EpCAM-CD45-মেট্ৰিক্স গ্লুক'জ গ্ৰহণ (2-NBDG) (E) আৰু মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল কাৰ্য্যকলাপ (MitoTracker গাঢ় ৰঙা) (F) প্ৰতিনিধিত্বমূলক গ্ৰাফ (বাওঁফালে) আৰু টেবুলযুক্ত তথ্য ( সোঁফালে) জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰ কোষ। (G) ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ দ্বাৰা চিডি২৫, চিডি১৩৭ আৰু পিডি১ প্ৰকাশৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক গ্ৰাফ। (H আৰু I) CD4 + T কোষ (H) আৰু CD8 + T কোষ (I) ৰ ওপৰত CD25, CD137 আৰু PD1 প্ৰকাশ। (J আৰু K) CCR7 আৰু CD45ROৰ প্ৰকাশৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি নেইভ, কেন্দ্ৰীয় স্মৃতিশক্তি (Tcm), ইফেক্টৰ (Teff) আৰু ইফেক্টৰ মেমৰি (Tem) ফেন'টাইপ। জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত থকা CD4 + T কোষ (J) আৰু CD8 + T কোষ (K)ৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক ছবি (বাওঁফালে) আৰু টেবুলাৰ তথ্য (সোঁফালে)। যোৰযুক্ত t-পৰীক্ষাৰ দ্বাৰা নিৰ্ধাৰিত P মান (*P<0.05, **P<0.01 আৰু ***P<0.001)। ৰেখাডালে মিল থকা ৰোগীক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে (n = 6)। এফএমঅ’, প্ৰতিসৰণ বিয়োগ এক; এম এফ আই, মধ্যম প্ৰতিসৰণ তীব্ৰতা।
অধিক বিশ্লেষণে অতি সমাধান হোৱা টি ​​কোষৰ ফেন’টাইপিক অৱস্থাৰ মাজত অন্যান্য উল্লেখযোগ্য পাৰ্থক্য উন্মোচন কৰে। টিউমাৰত সক্ৰিয় (চিত্ৰ ১, জিৰ পৰা আইলৈ) আৰু ইফেক্টৰ মেম’ৰী (চিত্ৰ ১, জে আৰু কে) জলসিঞ্চিত (চিডি৩ + টি কোষৰ অনুপাত)তকৈ বহু বেছি সঘনাই দেখা যায়। একেদৰে, সক্ৰিয়কৰণ মাৰ্কাৰ (CD25 আৰু CD137) আৰু ডিপ্লিচন মাৰ্কাৰ [প্ৰগ্ৰেমড কোষ মৃত্যু প্ৰটিন 1 (PD1)] প্ৰকাশৰ দ্বাৰা ফেন'টাইপ বিশ্লেষণ কৰিলে দেখা গ'ল যে যদিও এই জনসংখ্যাৰ বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য বেলেগ (চিত্ৰ S1, B to E) , কিন্তু নেইভ, ইফেক্টৰ বা স্মৃতিশক্তিৰ উপগোটৰ মাজত কোনো উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পাৰ্থক্য ধাৰাবাহিকভাৱে দেখা পোৱা নগ'ল (চিত্ৰ S1, F ৰ পৰা I)। এই ফলাফলসমূহ মেচিন লাৰ্নিং পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰি কোষৰ ফেন’টাইপ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে নিযুক্ত কৰি নিশ্চিত কৰা হৈছিল (২১), যিয়ে ৰোগীৰ জলসিঞ্চনত বৃহৎ সংখ্যক হাড়ৰ মজ্জাৰ কোষ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +)ৰ উপস্থিতি আৰু অধিক প্ৰকাশ কৰিছিল (চিত্ৰ S2A)। চিনাক্ত কৰা সকলো কোষ প্ৰকাৰৰ ভিতৰত এই মাইল’ইড কোষৰ জনসংখ্যাই সৰ্বাধিক গ্লুক’জ গ্ৰহণ আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ দেখুৱাইছিল (চিত্ৰ S2, B ৰ পৰা G)। এই ফলাফলসমূহে এইচ জি এছ চি ৰোগীৰ জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত পোৱা একাধিক কোষৰ প্ৰকাৰৰ মাজত থকা প্ৰবল বিপাকীয় পাৰ্থক্যক উজ্জ্বল কৰি তুলিছে।
টি আই এলৰ বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য বুজিবলৈ মূল প্ৰত্যাহ্বানটো হ’ল টিউমাৰৰ পৰা পৰ্যাপ্ত বিশুদ্ধতা, গুণগত মান আৰু পৰিমাণৰ টি কোষৰ নমুনা পৃথক কৰাৰ প্ৰয়োজনীয়তা। শেহতীয়া গৱেষণাই দেখুৱাইছে যে ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি ছৰ্টিং আৰু বিড সমৃদ্ধি পদ্ধতিয়ে কোষীয় বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰফাইলৰ পৰিৱৰ্তন ঘটাব পাৰে (২২-২৪)। এই সমস্যা দূৰ কৰিবলৈ আমি LC-MS/MS দ্বাৰা বিশ্লেষণৰ পূৰ্বে অস্ত্ৰোপচাৰৰ দ্বাৰা ৰিচেক্ট কৰা মানৱ ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ পৰা TIL পৃথক আৰু পৃথক কৰিবলৈ বিড সমৃদ্ধি পদ্ধতি অনুকূল কৰিলোঁ (উপাদান আৰু পদ্ধতি চাওক; চিত্ৰ 2A)। বিপাকীয় পদাৰ্থৰ পৰিৱৰ্তনৰ ওপৰত এই প্ৰট’কলৰ সামগ্ৰিক প্ৰভাৱ মূল্যায়ন কৰিবলৈ আমি ওপৰৰ গুটি পৃথকীকৰণ পদক্ষেপৰ পিছত সুস্থ দাতাই সক্ৰিয় কৰা টি কোষৰ বিপাকীয় প্ৰফাইলক গুটি পৃথক নোহোৱা কিন্তু বৰফৰ ওপৰত থকা কোষৰ সৈতে তুলনা কৰিলোঁ। এই গুণগত নিয়ন্ত্ৰণ বিশ্লেষণত দেখা গৈছে যে এই দুটা অৱস্থাৰ মাজত উচ্চ সম্পৰ্ক আছে (r = 0.77), আৰু ৮৬টা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ গোটটোৰ কাৰিকৰী পুনৰাবৃত্তিযোগ্যতাৰ উচ্চ পুনৰাবৃত্তিযোগ্যতা আছে (চিত্ৰ ২B)। গতিকে এই পদ্ধতিসমূহে কোষৰ প্ৰকাৰ সমৃদ্ধিৰ অধীনত থকা কোষসমূহত সঠিক বিপাকীয় পদাৰ্থ বিশ্লেষণ কৰিব পাৰে, যাৰ ফলত এইচ জি এছ চিত নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পদাৰ্থ চিনাক্তকৰণৰ বাবে প্ৰথম উচ্চ-ৰিজ’লিউচনৰ মঞ্চ প্ৰদান কৰা হয়, যাৰ ফলত মানুহে কোষৰ নিৰ্দিষ্টতাৰ বিষয়ে গভীৰ বুজাবুজি লাভ কৰিব পাৰে যৌন বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ কাৰ্যসূচী।
(ক) চুম্বকীয় গুটি সমৃদ্ধিৰ আঁচনিমূলক আঁক। এল চি-এম এছ/এম এছৰ দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰাৰ আগতে কোষবোৰ একেৰাহে তিনিটা ৰাউণ্ডৰ চুম্বকীয় গুটি সমৃদ্ধিৰ সন্মুখীন হ’ব বা বৰফৰ ওপৰত থাকিব। (খ) বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰাচুৰ্য্যৰ ওপৰত সমৃদ্ধিৰ প্ৰকাৰৰ প্ৰভাৱ। প্ৰতিটো সমৃদ্ধি প্ৰকাৰৰ বাবে তিনিটা জোখৰ গড় ± SE। ধূসৰ ৰেখাই ১:১ সম্পৰ্কক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। অক্ষ লেবেলত দেখুওৱা বাৰম্বাৰ জোখৰ আন্তঃশ্ৰেণী সম্পৰ্ক (ICC)। NAD, নিকোটিনামাইড এডেনিন ডাইনিউক্লিঅ’টাইড। (গ) ৰোগীৰ বিপাকীয় পদাৰ্থ বিশ্লেষণৰ কৰ্মপ্ৰবাহৰ আৰ্হি চিত্ৰ। ৰোগীৰ পৰা জলসিঞ্চন বা টিউমাৰ সংগ্ৰহ কৰি ক্ৰাইঅ’প্ৰিজাৰ্ভ কৰা হয়। প্ৰতিটো নমুনাৰ এটা সৰু অংশ ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল, আনহাতে বাকী নমুনাবোৰত চিডি৪+, চিডি৮+ আৰু চিডি৪৫- কোষৰ বাবে তিনিটা ৰাউণ্ড সমৃদ্ধি কৰা হৈছিল। এই কোষৰ অংশবোৰ এল চি-এম এছ/এম এছ ব্যৱহাৰ কৰি বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। (ঘ) মানক বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰাচুৰ্য্যৰ তাপৰ মানচিত্ৰ। ডেণ্ড্ৰগ্ৰামে নমুনাৰ মাজৰ ইউক্লিডীয় দূৰত্বৰ ৱাৰ্ডৰ ক্লাষ্টাৰিংক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। (ঙ) নমুনা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ মানচিত্ৰৰ প্ৰধান উপাদান বিশ্লেষণ (পিচিএ), প্ৰতিটো নমুনাৰ তিনিটা প্ৰতিলিপি দেখুওৱা, একেজন ৰোগীৰ নমুনা এটা ৰেখাৰে সংযুক্ত কৰা হয়। (F) ৰোগীৰ ওপৰত চৰ্তযুক্ত নমুনাৰ বিপাকীয় প্ৰফাইলৰ পিচিএ (অৰ্থাৎ, আংশিক অতিৰিক্ততা ব্যৱহাৰ কৰি); নমুনাৰ ধৰণ উত্তল হালৰ দ্বাৰা সীমিত। পিচি১, মূল উপাদান ১; PC2, মূল উপাদান 2।
ইয়াৰ পিছত আমি এই সমৃদ্ধি পদ্ধতি প্ৰয়োগ কৰি ছয়জন HGSC ৰোগীৰ প্ৰাথমিক জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত থকা CD4 +, CD8 + আৰু CD45-কোষৰ অংশত থকা ৯৯টা বিপাকীয় পদাৰ্থ বিশ্লেষণ কৰিলোঁ (চিত্ৰ ২C, চিত্ৰ S3A আৰু সূচী S3 আৰু S4)। আগ্ৰহৰ জনসংখ্যাই জীৱিত কোষৰ মূল বৃহৎ নমুনাৰ ২%ৰ পৰা ৭০% ভাগ লয় আৰু ৰোগীৰ মাজত কোষৰ অনুপাত বহু পৰিমাণে ভিন্ন হয়। গুটিবোৰ পৃথক কৰাৰ পিছত আগ্ৰহৰ সমৃদ্ধ অংশ (CD4+, CD8+ বা CD45-) গড়ে নমুনাৰ সকলো জীৱিত কোষৰ ৮৫%তকৈ অধিক। এই সমৃদ্ধি পদ্ধতিৰ দ্বাৰা আমি মানুহৰ টিউমাৰৰ কলাৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ পৰা কোষৰ জনসংখ্যা বিশ্লেষণ কৰিব পাৰো, যিটো বৃহৎ নমুনাৰ পৰা কৰাটো অসম্ভৱ। এই প্ৰট'কল ব্যৱহাৰ কৰি আমি নিৰ্ণয় কৰিলোঁ যে l-kynurenine আৰু adenosine, এই দুটা ভালদৰে বৈশিষ্ট্যযুক্ত ইমিউন'চাপ্ৰেচিভ বিপাকীয় পদাৰ্থ টিউমাৰ টি কোষ বা টিউমাৰ কোষত উচ্চ হয় (চিত্ৰ S3, B আৰু C)। গতিকে এই ফলাফলসমূহে আমাৰ কোষ পৃথকীকৰণ আৰু গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান প্ৰযুক্তিয়ে ৰোগীৰ কলাত জৈৱিকভাৱে গুৰুত্বপূৰ্ণ বিপাকীয় পদাৰ্থ বিচাৰি উলিওৱাৰ নিষ্ঠা আৰু ক্ষমতা প্ৰদৰ্শন কৰে।
আমাৰ বিশ্লেষণে ৰোগীৰ ভিতৰত আৰু ৰোগীৰ মাজত কোষৰ প্ৰকাৰৰ শক্তিশালী বিপাকীয় পৃথকীকৰণো প্ৰকাশ কৰে (চিত্ৰ ২D আৰু চিত্ৰ S4A)। বিশেষকৈ আন ৰোগীৰ তুলনাত ৭০ জন ৰোগীয়ে বিভিন্ন বিপাকীয় বৈশিষ্ট্য দেখুৱাইছিল (চিত্ৰ ২E আৰু চিত্ৰ S4B), ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে ৰোগীৰ মাজত বিপাকীয় বৈষম্য যথেষ্ট হ’ব পাৰে। মন কৰিবলগীয়া যে আন ৰোগীৰ তুলনাত (১.২ৰ পৰা ২ লিটাৰ; সূচী S1) ৭০ জন ৰোগীৰ (৮০ মিলিলিটাৰ) সংগ্ৰহ কৰা মুঠ জলসিঞ্চনৰ পৰিমাণ কম আছিল। মূল উপাদান বিশ্লেষণৰ সময়ত আন্তঃৰোগীৰ বৈষম্যৰ নিয়ন্ত্ৰণে (উদাহৰণস্বৰূপে, আংশিক অতিৰিক্ততা বিশ্লেষণ ব্যৱহাৰ কৰি) কোষৰ প্ৰকাৰৰ মাজত সামঞ্জস্যপূৰ্ণ পৰিৱৰ্তন দেখুৱায়, আৰু কোষৰ প্ৰকাৰ আৰু/বা অণুপৰিৱেশ বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰফাইল অনুসৰি স্পষ্টভাৱে একত্ৰিত কৰা হয় (চিত্ৰ ২F)। একক বিপাকীয় পদাৰ্থৰ বিশ্লেষণে এই প্ৰভাৱসমূহৰ ওপৰত গুৰুত্ব আৰোপ কৰিছিল আৰু কোষৰ প্ৰকাৰ আৰু অণুপৰিৱেশৰ মাজত যথেষ্ট পাৰ্থক্য উন্মোচন কৰিছিল। মন কৰিবলগীয়া যে আটাইতকৈ চৰম পাৰ্থক্যটো হৈছে এম এন এ, যিটো সাধাৰণতে চি ডি ৪৫- কোষ আৰু টিউমাৰত অনুপ্ৰৱেশ কৰা চি ডি ৪+ আৰু চি ডি ৮+ কোষত সমৃদ্ধ হয় (চিত্ৰ ৩A)। CD4 + কোষৰ বাবে এই প্ৰভাৱ আটাইতকৈ স্পষ্ট, আৰু CD8 + কোষৰ MNAও পৰিৱেশৰ দ্বাৰা প্ৰবলভাৱে প্ৰভাৱিত হোৱা যেন লাগে। কিন্তু এইটো গুৰুত্বপূৰ্ণ নহয়, কাৰণ ছয়জন ৰোগীৰ ভিতৰত মাত্ৰ তিনিজনৰহে টিউমাৰৰ চিডি৮+ স্ক’ৰৰ বাবে মূল্যায়ন কৰিব পৰা যায়। এম এন এৰ উপৰিও জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ বিভিন্ন ধৰণৰ কোষত টি আই এলত দুৰ্বল বৈশিষ্ট্যযুক্ত অন্যান্য বিপাকীয় পদাৰ্থও ভিন্নভাৱে সমৃদ্ধ (চিত্ৰ S3 আৰু S4)। গতিকে এই তথ্যসমূহে অধিক গৱেষণাৰ বাবে ইমিউন’মডুলেটৰী বিপাকীয় পদাৰ্থৰ এক আশাব্যঞ্জক গোট উন্মোচন কৰে।
(ক) জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ পৰা চিডি৪+, চিডি৮+ আৰু চিডি৪৫- কোষত এমএনএৰ স্বাভাৱিক পৰিমাণ। বক্স প্লটত মধ্যমা (ৰেখা), আন্তঃচতুৰ্থাংশ পৰিসৰ (ফ্ৰেম হিঞ্জ) আৰু তথ্য পৰিসৰ দেখুওৱা হৈছে, আন্তঃচতুৰ্থাংশ পৰিসৰৰ (ফ্ৰেম হুইস্কাৰ) ১.৫ গুণলৈকে। ৰোগীৰ সামগ্ৰী আৰু পদ্ধতিত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, P মান (*P<0.05 আৰু **P<0.01) নিৰ্ণয় কৰিবলৈ ৰোগীৰ লিমা মান ব্যৱহাৰ কৰক। (খ) এম এন এ বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ আঁচনিমূলক ডায়েগ্ৰাম (৬০)। বিপাকীয় পদাৰ্থ: এছ-এডিন’চাইল-১-মিথিঅ’নিন; SAH, S-এডিন’চিন-১-হোমোচিষ্টেইন; এন এ, নিকোটিনামাইড; এম এন এ, ১-মিথাইলনিকোটিনামাইড; ২-পিৱাই, ১-মিথাইল- ২-পাইৰিডন-৫-কাৰ্বক্সামাইড; ৪-পি ৱাই, ১-মিথাইল-৪-পাইৰিডন-৫-কাৰ্বক্সামাইড; এন আৰ, নিকোটিনামাইড ৰাইব’জ; এন এম এন, নিকোটিনামাইড মনোনিউক্লিঅ’টাইড। এনজাইম (সেউজীয়া): এন এন এম টি, নিকোটিনামাইড এন-মিথাইলট্ৰেন্সফেৰেজ; SIRT, চিৰ্টুইনছ; এন এ এম পি টি, নিকোটিনামাইড ফচফ’ৰিব’চাইল ট্ৰেন্সফেৰেজ; AOX1, এলডিহাইড অক্সিডেজ ১; এন আৰ কে, নিকোটিনামাইড ৰাইব’চাইড কাইনেজ; এনএমএনএটি, নিকোটিনামাইড মনো নিউক্লিঅ’টাইড এডিনাইলেট ট্ৰেন্সফেৰেজ; Pnp1, পিউৰিন নিউক্লিঅ’চাইড ফচফৰাইলেজ। (C) ascites (ধূসৰ) আৰু টিউমাৰ (ৰঙা; n = 3 ৰোগী) scRNA-seq ৰ t-SNE। (D) scRNA-seq ব্যৱহাৰ কৰি চিনাক্ত কৰা বিভিন্ন কোষ জনসংখ্যাত NNMT প্ৰকাশ। (ঙ) SK-OV-3, মানৱ ভ্ৰূণৰ বৃক্ক (HEK) 293T, T কোষ আৰু MNA-চিকিৎসা কৰা T কোষত NNMT আৰু AOX1ৰ প্ৰকাশ। ভাঁজ কৰা এক্সপ্ৰেচনটো SK-OV-3 ৰ সাপেক্ষে দেখুওৱা হৈছে। SEM ৰ সৈতে প্ৰকাশৰ আৰ্হি দেখুওৱা হৈছে (n = 6 সুস্থ দাতা)। ৩৫ তকৈ অধিক Ct মানক ধৰা নপৰা (UD) বুলি ধৰা হয়। (F) 8mM MNA দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা SK-OV-3, HEK293T, T কোষ আৰু T কোষত SLC22A1 আৰু SLC22A2 ৰ প্ৰকাশ। ভাঁজ কৰা এক্সপ্ৰেচনটো SK-OV-3 ৰ সাপেক্ষে দেখুওৱা হৈছে। SEM ৰ সৈতে প্ৰকাশৰ আৰ্হি দেখুওৱা হৈছে (n = 6 সুস্থ দাতা)। ৩৫ তকৈ অধিক Ct মানক ধৰা নপৰা (UD) বুলি ধৰা হয়। (G) এম এন এৰ সৈতে ৭২ ঘণ্টা ইনকিউবেচন কৰাৰ পিছত সক্ৰিয় সুস্থ দাতা টি কোষত কোষৰ এম এন এৰ পৰিমাণ। SEM ৰ সৈতে প্ৰকাশৰ আৰ্হি দেখুওৱা হৈছে (n = 4 সুস্থ দাতা)।
নিকোটিনামাইড N-মিথাইলট্ৰেন্সফেৰেজ (NNMT; চিত্ৰ ৩B) দ্বাৰা S-adenosyl-1-methionine (SAM)ৰ পৰা নিকোটিনামাইড (NA) লৈ মিথাইল গোটটো স্থানান্তৰ কৰি MNA উৎপন্ন হয়। এন এন এম টি মানুহৰ বিভিন্ন কৰ্কট ৰোগত অতিমাত্ৰা প্ৰকাশ পায় আৰু ই প্ৰসাৰ, আক্ৰমণ আৰু মেটাষ্টেছিছৰ সৈতে জড়িত (২৫-২৭)। টিএমইত টি কোষত এমএনএৰ উৎস ভালদৰে বুজিবলৈ আমি তিনিজন এইচজিএছচি ৰোগীৰ জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰত কোষৰ প্ৰকাৰৰ মাজেৰে এনএনএমটিৰ প্ৰকাশৰ বৈশিষ্ট্য নিৰ্ণয় কৰিবলৈ scRNA-seq ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ (তালিকা S5)। প্ৰায় ৬,৫০০ কোষৰ বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ পৰিৱেশত এন এন এম টি প্ৰকাশ অনুমান কৰা ফাইব্ৰ’ব্লাষ্ট আৰু টিউমাৰ কোষৰ জনসংখ্যাত সীমাবদ্ধ আছিল (চিত্ৰ ৩, চি আৰু ডি)। মন কৰিবলগীয়া যে পিটিপিআৰচি (চিডি৪৫ +) প্ৰকাশ কৰা কোনো জনসংখ্যাতে এনএনএমটিৰ কোনো স্পষ্ট প্ৰকাশ নাই (চিত্ৰ ৩ডি আৰু চিত্ৰ এছ৫এ), যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে বিপাকীয় বৰ্ণালীত ধৰা পৰা এমএনএ টি কোষত প্ৰৱেশ কৰা হৈছে। এলডিহাইড অক্সিডেজ ১ (AOX1)ৰ প্ৰকাশে MNAক ১-মিথাইল-২-পাইৰিডন-৫-কাৰ্বক্সামাইড (২-PYR) বা ১-মিথাইল-৪-পাইৰিডন-৫-কাৰ্বক্সামাইড (৪- PYR)লৈ ৰূপান্তৰিত কৰে; চিত্ৰ ৩B) COL1A1 প্ৰকাশ কৰা ফাইব্ৰ'ব্লাষ্টৰ জনসংখ্যাৰ মাজতো সীমাবদ্ধ (চিত্ৰ S5A), যিবোৰে একেলগে ইংগিত দিয়ে যে টি কোষত প্ৰচলিত MNA বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ ক্ষমতাৰ অভাৱ। এই এমএনএ-সম্পৰ্কীয় জিনসমূহৰ প্ৰকাশৰ ধৰণ HGSC ৰোগীৰ পৰা জলসিঞ্চনৰ পৰা দ্বিতীয় স্বতন্ত্ৰ কোষ তথ্যৰ গোট ব্যৱহাৰ কৰি পৰীক্ষা কৰা হৈছিল (চিত্ৰ S5B; n = 6) (16)। ইয়াৰ উপৰিও এম এন এ দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা সুস্থ দাতা টি কোষৰ পৰিমাণগত পলিমেৰেজ শৃংখলাবদ্ধ বিক্ৰিয়া (qPCR) বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে নিয়ন্ত্ৰণ SK-OV-3 ডিম্বাশয়ৰ টিউমাৰ কোষৰ তুলনাত এন এন এম টি বা AOX1 প্ৰায় প্ৰকাশ পোৱা নাছিল (চিত্ৰ ৩E)। এই অপ্ৰত্যাশিত ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে ফাইব্ৰ’ব্লাষ্ট বা টিউমাৰৰ পৰা টিএমইৰ কাষৰীয়া টি কোষলৈ এমএনএ নিঃসৰণ হ’ব পাৰে।
যদিও প্ৰাৰ্থীসকলৰ ভিতৰত দ্ৰৱণীয় বাহক ২২ (SLC22) পৰিয়াল (SLC22A1, SLC22A2 আৰু SLC22A3) দ্বাৰা সংকেতযুক্ত জৈৱিক কেটিয়ন পৰিবহণকাৰী 1 ৰ পৰা 3 (OCT1, OCT2 আৰু OCT3) পৰিয়াল অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হৈছে, এমএনএৰ সম্ভাৱ্য পৰিবহণকাৰী এতিয়াও অসংজ্ঞায়িত (28)। সুস্থ দাতা টি কোষৰ পৰা mRNA ৰ QPCR এ SLC22A1 ৰ কম প্ৰকাশৰ মাত্ৰা দেখুৱাইছিল কিন্তু SLC22A2 ৰ ধৰা নপৰা মাত্ৰা দেখুৱাইছিল, যিয়ে নিশ্চিত কৰিছিল যে ইয়াক পূৰ্বে সাহিত্যত ৰিপৰ্ট কৰা হৈছে (চিত্ৰ 3F) (29)। ইয়াৰ বিপৰীতে SK-OV-3 অভেৰিয়ান টিউমাৰ কোষ ৰেখাই দুয়োটা পৰিবহণকাৰীৰ উচ্চ মাত্ৰা প্ৰকাশ কৰিছিল (চিত্ৰ ৩F)।
টি কোষৰ বিদেশী এম এন এ শোষণ কৰাৰ ক্ষমতা থকাৰ সম্ভাৱনা পৰীক্ষা কৰিবলৈ সুস্থ দাতা টি কোষক বিভিন্ন ঘনত্বৰ এম এন এৰ উপস্থিতিত ৭২ ঘণ্টা ধৰি সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল। বহিৰ্জাতীয় এমএনএৰ অনুপস্থিতিত এমএনএৰ কোষীয় পৰিমাণ ধৰা পেলাব নোৱাৰি (চিত্ৰ ৩জি)। কিন্তু বহিৰ্জাতীয় এমএনএৰ দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা সক্ৰিয় টি কোষত কোষত এমএনএৰ পৰিমাণ মাত্ৰা নিৰ্ভৰশীল বৃদ্ধি দেখা গৈছিল, ৬ মিলিমিটাৰ এমএনএ পৰ্যন্ত (চিত্ৰ ৩জি)। এই ফলাফলে ইংগিত দিয়ে যে পৰিবহণকাৰী প্ৰকাশৰ মাত্ৰা কম আৰু আন্তঃকোষীয় এমএনএ বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ বাবে দায়বদ্ধ মূল এনজাইমৰ অভাৱৰ পিছতো টিআইএলে এমএনএ গ্ৰহণ কৰিব পাৰে।
ৰোগীৰ টি কোষত থকা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ বৰ্ণালী আৰু ইন ভিট্ৰ’ এম এন এ শোষণ পৰীক্ষাই কেন্সাৰ-সংক্ৰান্তীয় ফাইব্ৰ’ব্লাষ্টে (CAF) এম এন এ নিঃসৰণ কৰাৰ সম্ভাৱনা বৃদ্ধি কৰে আৰু টিউমাৰ কোষে টি আই এলৰ ফেন’টাইপ আৰু কাৰ্য্য নিয়ন্ত্ৰণ কৰিব পাৰে। টি কোষৰ ওপৰত এম এন এৰ প্ৰভাৱ নিৰ্ণয় কৰিবলৈ এম এন এৰ উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিত ইন ভিট্ৰ’ত সুস্থ দাতা টি কোষ সক্ৰিয় কৰা হৈছিল আৰু ইহঁতৰ প্ৰসাৰ আৰু চাইট’কাইন উৎপাদনৰ মূল্যায়ন কৰা হৈছিল। সৰ্বোচ্চ মাত্ৰাত এম এন এ যোগ কৰাৰ ৭ দিনৰ পিছত জনসংখ্যা দুগুণ হোৱাৰ সংখ্যা মধ্যমীয়াভাৱে হ্ৰাস পায়, আনহাতে সকলো মাত্ৰাতে শক্তি বজাই ৰখা হয় (চিত্ৰ ৪A)। ইয়াৰ উপৰিও বহিৰ্জাতীয় এমএনএৰ চিকিৎসাৰ ফলত টিউমাৰ নেক্ৰচিছ ফ্যাক্টৰ-α (TNFα; চিত্ৰ ৪B) প্ৰকাশ কৰা CD4 + আৰু CD8 + T কোষৰ অনুপাত বৃদ্ধি পায়। ইয়াৰ বিপৰীতে CD4 + T কোষত IFN-γ ৰ আন্তঃকোষীয় উৎপাদন যথেষ্ট হ্ৰাস পাইছিল, কিন্তু CD8 + T কোষত নহয়, আৰু ইন্টাৰলিউকিন 2 (IL-2; চিত্ৰ 4, C আৰু D) ত কোনো বিশেষ পৰিৱৰ্তন হোৱা নাছিল। গতিকে এই এম এন এ-চিকিৎসা কৰা টি কোষ সংস্কৃতিৰ পৰা চুপাৰনেটেণ্টৰ এনজাইম-লিংকড ইমিউন’ছৰবেণ্ট এছেই (ELISA)ত TNFα যথেষ্ট বৃদ্ধি পোৱা, IFN-γ হ্ৰাস পোৱা আৰু IL-2 ৰ কোনো পৰিৱৰ্তন হোৱা দেখা গৈছিল (চিত্ৰ ৪, ইৰ পৰা জিলৈ)। . IFN-γ হ্ৰাস পোৱাটোৱে ইংগিত দিয়ে যে MNA এ টি কোষৰ এণ্টি-টিউমাৰ কাৰ্য্যকলাপক বাধা দিয়াত ভূমিকা ল’ব পাৰে। টি কোষ-মধ্যস্থতাকাৰী চাইট’টক্সিচিটিৰ ওপৰত এমএনএৰ প্ৰভাৱ অনুকৰণ কৰিবলৈ, গ্ৰীণ ফ্লু’ৰেচেণ্ট প্ৰ’টিন (GFP) -CAR-T) কোষৰ দ্বাৰা নিয়ন্ত্ৰিত ফ’লেট ৰিচেপ্টৰ α আৰু CAR-T (GFP)ক লক্ষ্য কৰি চাইমেৰিক এন্টিজেন ৰিচেপ্টৰ টি (FRα-CAR-T) কোষ সুস্থ দাতাৰ পেৰিফেৰেল ব্লাড মনোনিউক্লিয়াৰ কোষ (PBMC) দ্বাৰা উৎপন্ন কৰা হয়। CAR-T কোষক MNA ৰ উপস্থিতিত ২৪ ঘণ্টা ধৰি সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত মানৱ SK-OV-3 ডিম্বাশয়ৰ টিউমাৰ কোষৰ সৈতে ফোলেট ৰিচেপ্টৰ α প্ৰকাশ কৰা ১০:১ ইফেক্টৰ আৰু লক্ষ্য অনুপাতত সহ-কালচাৰ কৰা হৈছিল। এম এন এ চিকিৎসাৰ ফলত FRα-CAR-T কোষৰ হত্যাৰ কাৰ্য্যকলাপ যথেষ্ট হ্ৰাস পায়, যিটো এডিন’চিন দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা FRα-CAR-T কোষৰ সৈতে একে (চিত্ৰ ৪H)।
(A) ৭ম দিনত কালচাৰৰ পৰা পোনপটীয়াকৈ মুঠ জীৱনমুখী কোষৰ সংখ্যা আৰু জনসংখ্যা দুগুণ হোৱা (PD)। বাৰ গ্ৰাফে ছয়জন সুস্থ দাতাৰ গড় + SEM প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। অন্ততঃ n = 3 টা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ তথ্য প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। (B to D) CD3/CD28 আৰু IL-2 ব্যৱহাৰ কৰি টি কোষক নিজ নিজ MNA ঘনত্বত ৭ দিনৰ বাবে সক্ৰিয় কৰা হৈছিল। বিশ্লেষণৰ পূৰ্বে কোষবোৰক গলজিষ্টপৰ সৈতে পিএমএ/আইঅ’ন’মাইচিনেৰে ৪ ঘণ্টা ধৰি উদ্দীপিত কৰা হৈছিল। টি কোষত TNFα (B) প্ৰকাশ। জীৱিত কোষত TNFα প্ৰকাশৰ উদাহৰণ ছবি (বাওঁফালে) আৰু টেবুলাৰ তথ্য (সোঁফালে)। টি কোষত IFN-γ (C) আৰু IL-2 (D) প্ৰকাশ। চাইট’কাইনৰ প্ৰকাশ ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ দ্বাৰা জুখিছিল। বাৰ গ্ৰাফে গড় (n = 6 সুস্থ দাতা) + SEM প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। P মান নিৰ্ণয় কৰিবলৈ ভ্যাৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ আৰু পুনৰাবৃত্তিমূলক পদক্ষেপ (*P<0.05 আৰু **P<0.01) ব্যৱহাৰ কৰক। অন্ততঃ n = 3 টা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ তথ্য প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। (E to G) CD3/CD28 আৰু IL-2 ব্যৱহাৰ কৰি টি কোষক নিজ নিজ MNA ঘনত্বত ৭ দিনৰ বাবে সক্ৰিয় কৰা হৈছিল। পিএমএ/আইঅ’ন’মাইচিন উদ্দীপনা ৪ ঘণ্টাৰ আগতে আৰু পিছত মাধ্যমটো সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল। TNFα (E), IFN-γ (F) আৰু IL-2 (G) ৰ ঘনত্ব ELISA দ্বাৰা জুখিছিল। বাৰ গ্ৰাফে গড় (n = 5 সুস্থ দাতা) + SEM প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। ভ্যাৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ আৰু পুনৰাবৃত্তিমূলক জোখ (*P<0.05) ব্যৱহাৰ কৰি P মান নিৰ্ধাৰণ কৰা হয়। বিন্দুযুক্ত ৰেখাই ধৰা পেলোৱাৰ ধৰা পেলোৱা সীমা সূচায়। (H) কোষ লাইছিছ পৰীক্ষা। FRα-CAR-T বা GFP-CAR-T কোষক এডিন’চিন (250μM) বা MNA (10 mM) দ্বাৰা ২৪ ঘণ্টা ধৰি সামঞ্জস্য কৰা হৈছিল, বা চিকিৎসা নকৰাকৈ ৰখা হৈছিল (Ctrl)। SK-OV-3 কোষৰ শতাংশ হত্যা জুখিছিল। ৱেলচ t পৰীক্ষাৰ দ্বাৰা নিৰ্ণয় কৰা P মান (*P<0.5 আৰু **P<0.01)।
এমএনএ-নিৰ্ভৰশীল টিএনএফএ এক্সপ্ৰেচন নিয়ন্ত্ৰণৰ বিষয়ে যান্ত্ৰিক বুজাবুজি লাভ কৰিবলৈ এমএনএ-চিকিৎসা কৰা টি কোষৰ টিএনএফএ এমআৰএনএৰ পৰিৱৰ্তনৰ মূল্যায়ন কৰা হৈছিল (চিত্ৰ ৫এ)। এম এন এৰ দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা সুস্থ দাতা টি কোষত টি এন এফ এ ট্ৰান্সক্ৰিপচনৰ মাত্ৰা দুগুণ বৃদ্ধি হোৱা দেখা গৈছিল, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে এম এন এ টি এন এফ এ ট্ৰান্সক্ৰিপচনেল নিয়ন্ত্ৰণৰ ওপৰত নিৰ্ভৰশীল। এই সম্ভাৱ্য নিয়ন্ত্ৰণ ব্যৱস্থা অনুসন্ধান, TNFα নিয়ন্ত্ৰণ যে দুটা জনা ট্ৰান্সক্ৰিপচন ফ্যাক্টৰ, যথা সক্ৰিয় টি কোষ নিউক্লিয়াৰ ফ্যাক্টৰ (NFAT) আৰু নিৰ্দিষ্ট প্ৰটিন 1 (Sp1), প্ৰক্সিমেল TNFα প্ৰ'ম'টাৰ ( 30 ) MNA বান্ধনি প্ৰতিক্ৰিয়াত মূল্যায়ন কৰা হৈছিল. TNFα প্ৰ'ম'টাৰত ৬টা চিনাক্তকৃত NFAT বান্ধনি স্থান আৰু ২টা Sp1 বান্ধনি স্থান থাকে, যিটো এটা স্থানত ওপৰত ওপৰ সোমাই থাকে [5'cap ৰ পৰা -৫৫টা ভিত্তি যোৰ (bp)] (৩০)। ক্ৰ’মেটিন ইমিউন’প্ৰেচিপিটেচনে (ChIP) দেখুৱাইছে যে MNA দ্বাৰা চিকিৎসা কৰিলে Sp1 ৰ TNFα প্ৰ’ম’টাৰৰ সৈতে বান্ধোন তিনিগুণ বৃদ্ধি পায়। এন এফ এ টিৰ অন্তৰ্ভুক্তিও বৃদ্ধি পাইছিল আৰু গুৰুত্বৰ কাষ চাপিছিল (চিত্ৰ ৫বি)। এই তথ্যসমূহে ইংগিত দিয়ে যে MNA এ Sp1 ট্ৰান্সক্ৰিপচনৰ জৰিয়তে TNFα ৰ প্ৰকাশ নিয়ন্ত্ৰণ কৰে, আৰু কম পৰিমাণে NFAT ৰ প্ৰকাশ নিয়ন্ত্ৰণ কৰে।
(A) MNA অবিহনে কালচাৰ কৰা T কোষৰ তুলনাত MNA দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা T কোষত TNFα প্ৰকাশৰ ভাঁজ পৰিৱৰ্তন। SEM ৰ সৈতে প্ৰকাশৰ আৰ্হি দেখুওৱা হৈছে (n = 5 সুস্থ দাতা)। অন্ততঃ n = 3 টা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ তথ্য প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। (B) NFAT আৰু Sp1 ৰ পিছত 8 mM MNA ৰ সৈতে বা অবিহনে চিকিৎসা কৰা T কোষৰ TNFα প্ৰ'ম'টাৰক (Ctrl) আৰু PMA/ionomycin উদ্দীপনাৰে 4 ঘণ্টা ধৰি সংযুক্ত কৰা হৈছিল। ইমিউন’প্ৰেচিপিটেচনৰ বাবে ক্ৰমে ঋণাত্মক আৰু ধনাত্মক নিয়ন্ত্ৰণ হিচাপে ইমিউন’গ্ল’বিউলিন জি (IgG) আৰু এইচ ৩ ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ChIP ৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰিলে দেখা গ’ল যে MNA-চিকিৎসা কৰা কোষত Sp1 আৰু NFAT ৰ TNFα প্ৰ’ম’টাৰৰ সৈতে বান্ধোন নিয়ন্ত্ৰণৰ তুলনাত কেইবাগুণো বৃদ্ধি পায়। অন্ততঃ n = 3 টা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ তথ্য প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। একাধিক t-পৰীক্ষাৰ দ্বাৰা নিৰ্ধাৰিত P মান (*** P <0.01)। (গ) এইচ জি এছ চিৰ জলসিঞ্চনৰ তুলনাত টি কোষ (নন-চাইট’টক্সিক)ত টিউমাৰত টি এন এফৰ প্ৰকাশ বৃদ্ধি পোৱা দেখা গৈছিল। ৰংবোৰে বিভিন্ন ৰোগীক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। প্ৰদৰ্শিত কোষসমূহক ৩০০ লৈ যাদৃচ্ছিকভাৱে নমুনা সংগ্ৰহ কৰা হৈছে আৰু অভাৰড্ৰয়িং সীমিত কৰিবলৈ জিটাৰ কৰা হৈছে (** Padj = 0.0076)। (ঘ) ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ বাবে এম এন এৰ প্ৰস্তাৱিত আৰ্হি। এম এন এ টিউমাৰ কোষ আৰু টি এম ইত ফাইব্ৰ’ব্লাষ্টত উৎপন্ন হয় আৰু টি কোষে গ্ৰহণ কৰে। MNA এ Sp1 ৰ TNFα প্ৰ’ম’টাৰৰ সৈতে বান্ধোন বৃদ্ধি কৰে, যাৰ ফলত TNFα ট্ৰান্সক্ৰিপচন আৰু TNFα চাইট’কাইন উৎপাদন বৃদ্ধি পায়। MNA ৰ ফলত IFN-γ ৰ পৰিমাণো হ্ৰাস পায়। টি কোষৰ কাৰ্য্যত বাধা আহিলে হত্যাৰ ক্ষমতা হ্ৰাস পায় আৰু টিউমাৰৰ বৃদ্ধি ত্বৰান্বিত হয়।
প্ৰতিবেদন অনুসৰি TNFα ৰ সন্মুখ আৰু পিছফালৰ ওপৰত নিৰ্ভৰশীল এণ্টি-টিউমাৰ আৰু এণ্টি-টিউমাৰ প্ৰভাৱ আছে যদিও ইয়াৰ ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ বৃদ্ধি আৰু মেটাষ্টেছিছৰ ক্ষেত্ৰত সুপৰিচিত ভূমিকা আছে (৩১-৩৩)। প্ৰতিবেদন অনুসৰি ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগীৰ জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ কলাত TNFαৰ ঘনত্ব বিনাইন কলাতকৈ বেছি (৩৪-৩৬)। ব্যৱস্থাৰ ক্ষেত্ৰত TNFα এ শ্বেত ৰক্তকণিকাৰ সক্ৰিয়কৰণ, কাৰ্য্য আৰু প্ৰসাৰ নিয়ন্ত্ৰণ কৰিব পাৰে, আৰু কেন্সাৰ কোষৰ ফেন’টাইপ সলনি কৰিব পাৰে (37, 38)। এই তথ্যসমূহৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে, ভিন্নতামূলক জিন প্ৰকাশ বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে জলসিঞ্চনৰ তুলনাত টিউমাৰৰ কলাত টি কোষত টিএনএফ যথেষ্ট পৰিমাণে আপ-ৰেগুলেটেড (চিত্ৰ ৫চি)। টি এন এফ প্ৰকাশৰ বৃদ্ধি কেৱল নন-চাইট’টক্সিক ফেন’টাইপ থকা টি কোষৰ জনসংখ্যাতহে দেখা গৈছিল (চিত্ৰ S5A)। সামৰণিত ক’বলৈ গ’লে এই তথ্যসমূহে এই মতামত সমৰ্থন কৰে যে এম এন এৰ এইচ জি এছ চিত দ্বৈত ইমিউন’চাপ্ৰেচিভ আৰু টিউমাৰ প্ৰসাৰক প্ৰভাৱ আছে।
ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি ফ্লু’ৰেচেণ্ট লেবেলিং টিআইএল বিপাকীয় ক্ৰিয়া অধ্যয়নৰ বাবে মূল পদ্ধতিত পৰিণত হৈছে। এই অধ্যয়নসমূহে দেখুৱাইছে যে পেৰিফেৰেল ব্লাড লিম্ফোচাইট বা গৌণ লিম্ফ’ইড অংগৰ পৰা টি কোষৰ তুলনাত মাউৰিন আৰু মানুহৰ টি আই এলৰ গ্লুক’জ গ্ৰহণ কৰাৰ প্ৰৱণতা বেছি (৪, ৩৯) আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যক্ষমতা ক্ৰমান্বয়ে হেৰুৱাই পেলায় (১৯, ৪০)। যদিও আমি এই অধ্যয়নত একেধৰণৰ ফলাফল পৰ্যবেক্ষণ কৰিছো, মূল বিকাশ হৈছে একেটা ৰিচেক্ট কৰা টিউমাৰ কলাৰ পৰা টিউমাৰ কোষ আৰু টিআইএলৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়া তুলনা কৰা। এই পূৰ্বৰ কিছুমান প্ৰতিবেদনৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে, জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ পৰা অহা টিউমাৰ (CD45-EpCAM +) কোষত চিডি৮ + আৰু চিডি৪ + টি কোষতকৈ অধিক গ্লুক’জ গ্ৰহণ হয়, যিয়ে সমৰ্থন কৰে যে টিউমাৰ কোষৰ উচ্চ গ্লুক’জ গ্ৰহণক টি কোষৰ সৈতে তুলনা কৰিব পাৰি। টি কোষ প্ৰতিযোগিতাৰ ধাৰণা। টিএমই। কিন্তু টিউমাৰ কোষৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ CD8 + T কোষতকৈ বেছি যদিও মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ CD4 + T কোষৰ দৰেই। এই ফলাফলসমূহে উদীয়মান বিষয়বস্তুটোক শক্তিশালী কৰে যে অক্সিডেটিভ বিপাকীয় ক্ৰিয়া টিউমাৰ কোষৰ বাবে গুৰুত্বপূৰ্ণ (৪১, ৪২)। তেওঁলোকে এইটোও কয় যে CD4 + T কোষবোৰ CD4 + T কোষতকৈ অক্সিডেটিভ ডিছফংচনৰ প্ৰতি অধিক সহজলভ্য হ’ব পাৰে, বা CD4 + T কোষে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপ বজাই ৰাখিবলৈ গ্লুক’জৰ বাহিৰে আন কাৰ্বনৰ উৎস ব্যৱহাৰ কৰিব পাৰে (43, 44)। মন কৰিবলগীয়া যে আমি জলসিঞ্চনত চিডি৪ + টি ইফেক্টৰ, টি ইফেক্টৰ মেম’ৰী আৰু টি চেণ্ট্ৰেল মেম’ৰী কোষৰ মাজত গ্লুক’জ গ্ৰহণ বা মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপৰ কোনো পাৰ্থক্য দেখা নাপালোঁ। একেদৰে টিউমাৰত CD8 + T কোষৰ পাৰ্থক্য অৱস্থাৰ সৈতে গ্লুক’জ গ্ৰহণৰ পৰিৱৰ্তনৰ কোনো সম্পৰ্ক নাই, যিয়ে ইন ভিট্ৰ’ত কালচাৰ কৰা টি কোষ আৰু ইন ভিভ’ত মানৱ টিআইএলৰ মাজৰ উল্লেখযোগ্য পাৰ্থক্যক উজ্জ্বল কৰি তুলিছে (22)। এই পৰ্যবেক্ষণসমূহ নিৰপেক্ষ স্বয়ংক্ৰিয় কোষ জনসংখ্যা আবণ্টনৰ ব্যৱহাৰেও নিশ্চিত কৰা হৈছিল, যিয়ে আৰু প্ৰকাশ কৰিছিল যে টিউমাৰ কোষতকৈ অধিক গ্লুক’জ গ্ৰহণ আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল কাৰ্য্যকলাপ থকা CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + কোষ প্ৰচলিত যদিও বিপাকীয় সক্ৰিয় কোষৰ জনসংখ্যা থাকে। এই জনসংখ্যাই scRNA-seq বিশ্লেষণত চিনাক্ত কৰা মাইল'ইড চাপ্ৰেছৰ কোষ বা প্লাজমাচাইট'ইড ডেণ্ড্ৰাইটিক কোষৰ কল্পিত উপ-জনসংখ্যাক প্ৰতিনিধিত্ব কৰিব পাৰে। যদিও এই দুয়োটা মানুহৰ ডিম্বাশয়ৰ টিউমাৰত ৰিপৰ্ট কৰা হৈছে [45] , ইয়াৰ বাবে এতিয়াও প্ৰয়োজন এই মাইল'ইড উপ-জনসংখ্যাৰ বৰ্ণনা কৰা।
যদিও ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰি ভিত্তিক পদ্ধতিয়ে কোষৰ প্ৰকাৰৰ মাজত গ্লুক’জ আৰু অক্সিডেটিভ বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ সাধাৰণ পাৰ্থক্য স্পষ্ট কৰিব পাৰে, টিএমইত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ বাবে গ্লুক’জ বা অন্যান্য কাৰ্বনৰ উৎসৰ দ্বাৰা উৎপন্ন হোৱা নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পদাৰ্থ এতিয়াও নিৰ্ণয় কৰা হোৱা নাই। কোনো এটা TIL উপগোটত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি নিযুক্ত কৰিবলৈ আঁতৰোৱা কলাৰ পৰা কোষৰ জনসংখ্যা বিশুদ্ধ কৰাৰ প্ৰয়োজন হয়। গতিকে গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ সৈতে সংযুক্ত আমাৰ কোষ সমৃদ্ধি পদ্ধতিয়ে ৰোগীৰ নমুনাৰ মিলত টি কোষ আৰু টিউমাৰ কোষৰ জনসংখ্যাত পৃথকভাৱে সমৃদ্ধ হোৱা বিপাকীয় পদাৰ্থসমূহৰ বিষয়ে অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰিব পাৰে। যদিও এই পদ্ধতিৰ ফ্লু'ৰেচেন্স-সক্ৰিয় কোষ সজাই পৰাই তোলাতকৈ সুবিধা আছে, কিছুমান বিপাকীয় পদাৰ্থৰ লাইব্ৰেৰী অন্তৰ্নিহিত স্থিৰতা আৰু/বা দ্ৰুত টাৰ্ণঅভাৰৰ হাৰৰ বাবে প্ৰভাৱিত হ'ব পাৰে (22)। তথাপিও আমাৰ পদ্ধতিয়ে দুটা স্বীকৃতিপ্ৰাপ্ত ইমিউন’চাপ্ৰেচিভ বিপাকীয় পদাৰ্থ এডিন’চিন আৰু কিনুৰেনিন চিনাক্ত কৰিবলৈ সক্ষম হৈছিল, কাৰণ নমুনাৰ প্ৰকাৰৰ মাজত ইহঁতৰ বহু পৰিমাণে পাৰ্থক্য আছে।
টিউমাৰ আৰু টিআইএল উপপ্ৰকাৰৰ আমাৰ বিপাকীয় বিশ্লেষণে ডিম্বাশয়ৰ টিএমইত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ ভূমিকা সম্পৰ্কে অধিক অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে। প্ৰথমে ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰি ব্যৱহাৰ কৰি আমি নিৰ্ণয় কৰিলোঁ যে টিউমাৰ আৰু চিডি৪ + টি কোষৰ মাজত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপৰ কোনো পাৰ্থক্য নাই। কিন্তু এল চি-এম এছ/এম এছ বিশ্লেষণে এই জনসংখ্যাসমূহৰ মাজত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰাচুৰ্য্যৰ যথেষ্ট পৰিৱৰ্তন প্ৰকাশ কৰে, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে টি আই এল বিপাকীয় ক্ৰিয়া আৰু ইয়াৰ সামগ্ৰিক বিপাকীয় কাৰ্য্যকলাপৰ বিষয়ে সিদ্ধান্ত লোৱাৰ বাবে সতৰ্ক ব্যাখ্যাৰ প্ৰয়োজন। দ্বিতীয়তে, টিউমাৰত নহয়, জলসিঞ্চনত চিডি৪৫-কোষ আৰু টি কোষৰ মাজত সৰ্বাধিক পাৰ্থক্য থকা বিপাকীয় পদাৰ্থটোৱেই হৈছে এমএনএ। গতিকে কম্পাৰ্টমেণ্টেলাইজেচন আৰু টিউমাৰৰ অৱস্থানে টি আই এল বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ ওপৰত বিভিন্ন প্ৰভাৱ পেলাব পাৰে, যিয়ে এটা নিৰ্দিষ্ট অণুপৰিৱেশত সম্ভাৱ্য বৈষম্যক উজ্জ্বল কৰি তোলে। তৃতীয়তে, এম এন এ উৎপাদনকাৰী এনজাইম এন এন এম টিৰ প্ৰকাশ মূলতঃ চি এ এফত সীমাবদ্ধ থাকে, যিটো কম পৰিমাণে টিউমাৰ কোষ, কিন্তু টিউমাৰৰ পৰা আহৰণ কৰা টি কোষত ধৰা পৰা এম এন এৰ মাত্ৰা দেখা যায়। ডিম্বাশয়ৰ চিএএফত এনএনএমটিৰ অতিমাত্ৰা প্ৰকাশৰ কেন্সাৰ-প্ৰসাৰিত প্ৰভাৱ জনা যায়, আংশিকভাৱে চিএএফ বিপাকীয় ক্ৰিয়া, টিউমাৰৰ আক্ৰমণ আৰু মেটাষ্টেছিছৰ প্ৰসাৰৰ বাবে (২৭)। যদিও টিআইএলৰ সামগ্ৰিক মাত্ৰা মধ্যমীয়া, চিএএফত এনএনএমটিৰ প্ৰকাশ কেন্সাৰ জিনম এটলাছ (টিচিজিএ) মেচেনচাইমেল উপপ্ৰকাৰৰ সৈতে ওতঃপ্ৰোতভাৱে জড়িত, যিটো দুৰ্বল পূৰ্বাভাসৰ সৈতে জড়িত (২৭, ৪৬, ৪৭)। শেষত, এম এন এৰ অৱক্ষয়ৰ বাবে দায়বদ্ধ এ অ’ এক্স ১ এনজাইমৰ প্ৰকাশও চি এ এফ জনসংখ্যাৰ মাজতে সীমাবদ্ধ, যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে টি কোষত এম এন এ বিপাকীয় ক্ৰিয়া কৰাৰ ক্ষমতাৰ অভাৱ। এই ফলাফলসমূহে এই ধাৰণাটো সমৰ্থন কৰে যে যদিও এই তথ্য পৰীক্ষা কৰিবলৈ অধিক কামৰ প্ৰয়োজন, টি কোষত উচ্চ মাত্ৰাৰ এমএনএই ইমিউন’চাপ্ৰেচিভ চিএএফ মাইক্ৰ’পৰিৱেশৰ উপস্থিতিৰ ইংগিত দিব পাৰে।
এম এন এ পৰিবহণকাৰীৰ প্ৰকাশৰ মাত্ৰা কম আৰু এম এন এ বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ লগত জড়িত মূল প্ৰটিনৰ ধৰা নপৰা মাত্ৰাৰ প্ৰতি লক্ষ্য ৰাখি টি কোষত এম এন এৰ উপস্থিতি অপ্ৰত্যাশিত। দুটা স্বতন্ত্ৰ গোটৰ scRNA-seq বিশ্লেষণ আৰু লক্ষ্য qPCR দ্বাৰা NNMT বা AOX1 ধৰা পেলাব পৰা নগ'ল। এই ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে এম এন এ টি কোষৰ দ্বাৰা সংশ্লেষিত নহয়, বৰঞ্চ চাৰিওফালৰ টি এম ইৰ পৰা শোষিত হয়। ইন ভিট্ৰ’ পৰীক্ষাত দেখা গৈছে যে টি কোষে বহিৰ্জাতীয় এমএনএ জমা হোৱাৰ প্ৰৱণতা থাকে।
আমাৰ ইন ভিট্ৰ’ অধ্যয়নত দেখা গৈছে যে বহিৰ্জাতীয় এমএনএই টি কোষত টিএনএফএৰ প্ৰকাশ প্ৰৰোচিত কৰে আৰু টিএনএফএ প্ৰ’ম’টাৰৰ সৈতে Sp1ৰ বান্ধোন বৃদ্ধি কৰে। যদিও TNFα এ টিউমাৰ বিৰোধী আৰু টিউমাৰ বিৰোধী দুয়োটা কাম কৰে, ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগত TNFα এ ডিম্বাশয়ৰ কেন্সাৰৰ বৃদ্ধিত সহায় কৰিব পাৰে (৩১-৩৩)। ডিম্বাশয়ৰ টিউমাৰ কোষ সংস্কৃতিত TNFα ৰ নিষ্ক্ৰিয়কৰণ বা মাউছ মডেলত TNFα সংকেতৰ নিষ্কাশনে TNFα-মধ্যস্থতাকাৰী প্ৰদাহজনক চাইট'কাইন উৎপাদন উন্নত কৰিব পাৰে আৰু টিউমাৰৰ বৃদ্ধিত বাধা দিব পাৰে (32, 35)। গতিকে এই ক্ষেত্ৰত টিএমই-উত্পন্ন এমএনএই অটোক্ৰাইন লুপৰ জৰিয়তে টিএনএফএ-নিৰ্ভৰশীল ব্যৱস্থাৰ জৰিয়তে প্ৰদাহজনিত বিপাকীয় পদাৰ্থ হিচাপে কাম কৰিব পাৰে, যাৰ ফলত ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ সংঘটন আৰু বিস্তাৰক প্ৰসাৰিত হয় (৩১)। এই সম্ভাৱনাৰ ভিত্তিত ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ বাবে সম্ভাৱ্য চিকিৎসামূলক এজেণ্ট হিচাপে TNFα ব্লকক অধ্যয়ন কৰা হৈছে (37, 48, 49)। ইয়াৰ উপৰিও এম এন এয়ে ডিম্বাশয়ৰ টিউমাৰ কোষলৈ চি এ আৰ-টি কোষৰ চাইট’টক্সিচিটি বিকৃত কৰে, যাৰ ফলত এম এন এ-মধ্যস্থতাকাৰী প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা দমনৰ অধিক প্ৰমাণ পোৱা যায়। সামূহিকভাৱে এই ফলাফলসমূহে এনে এটা আৰ্হি প্ৰকাশ কৰে য’ত টিউমাৰ আৰু চি এ এফ কোষে বহিঃকোষীয় টি এম ইলৈ এম এন এ নিঃসৰণ কৰে। (i) টিএনএফ-প্ৰৰোচিত ডিম্বাশয়ৰ কৰ্কট ৰোগৰ বৃদ্ধিৰ উদ্দীপনা আৰু (ii) এমএনএ-প্ৰৰোচিত টি কোষৰ চাইট’টক্সিক কাৰ্য্যকলাপ নিষেধৰ জৰিয়তে ইয়াৰ দ্বৈত টিউমাৰ প্ৰভাৱ হ’ব পাৰে (চিত্ৰ ৫D)।
সামৰণিত ক’ব পাৰি যে দ্ৰুত কোষ সমৃদ্ধি, একক কোষ ক্ৰমবিন্যাস আৰু বিপাকীয় প্ৰফাইলিঙৰ সংমিশ্ৰণ প্ৰয়োগ কৰি এই অধ্যয়নে এইচ জি এছ চি ৰোগীৰ টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চন কোষৰ মাজত থকা বিশাল ইমিউন’মেটাব’ল’মিক পাৰ্থক্য উন্মোচন কৰিলে। এই বিস্তৃত বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে টি কোষৰ মাজত গ্লুক’জ গ্ৰহণ আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যকলাপৰ পাৰ্থক্য আছে, আৰু এম এন এক অকোষীয় স্বায়ত্তশাসিত প্ৰতিৰোধ নিয়ন্ত্ৰণ বিপাকীয় পদাৰ্থ হিচাপে চিনাক্ত কৰা হৈছে। এই তথ্যসমূহে মানুহৰ কৰ্কট ৰোগত টি এম ইয়ে টি কোষৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়াত কেনে প্ৰভাৱ পেলায় তাৰ ওপৰত প্ৰভাৱ পেলায়। যদিও টি কোষ আৰু কেন্সাৰ কোষৰ মাজত পুষ্টিকৰ উপাদানৰ বাবে প্ৰত্যক্ষ প্ৰতিযোগিতা হোৱাৰ কথা ৰিপৰ্ট কৰা হৈছে, বিপাকীয় পদাৰ্থই টিউমাৰৰ অগ্ৰগতি বৃদ্ধি কৰিবলৈ আৰু সম্ভৱতঃ অন্তৰ্জাতীয় প্ৰতিৰোধ সঁহাৰি দমন কৰিবলৈ পৰোক্ষ নিয়ন্ত্ৰক হিচাপেও কাম কৰিব পাৰে। এই নিয়ন্ত্ৰণকাৰী বিপাকীয় পদাৰ্থসমূহৰ কাৰ্য্যকৰী ভূমিকাৰ অধিক বৰ্ণনাই এণ্টি-টিউমাৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা বৃদ্ধিৰ বাবে বিকল্প কৌশল মুকলি কৰিব পাৰে।
ৰোগীৰ নমুনা আৰু ক্লিনিকেল তথ্য কানাডিয়ান টিছু ৰিপজিটৰী নেটৱৰ্কৰ দ্বাৰা প্ৰমাণিত বি চি কেন্সাৰ টিউমাৰ টিছু ভঁৰালৰ জৰিয়তে লাভ কৰা হৈছিল। বি চি কেন্সাৰ ৰিচাৰ্চ এথিক্স কমিটি আৰু ইউনিভাৰ্চিটি অৱ ব্ৰিটিছ কলম্বিয়াই অনুমোদন জনোৱা প্ৰট’কল অনুসৰি (H07-00463) সকলো ৰোগীৰ নমুনা আৰু ক্লিনিকেল তথ্যই অৱগত লিখিত সন্মতি লাভ কৰিছিল বা আনুষ্ঠানিকভাৱে সন্মতি ত্যাগ কৰিছিল। নমুনাসমূহ প্ৰমাণিত বায়’বেংক (BRC-00290)ত সংৰক্ষণ কৰা হয়। ৰোগীৰ বিশদ বৈশিষ্ট্য সূচী S1 আৰু S5 ত দেখুওৱা হৈছে। ক্ৰাইঅ’প্ৰিজাৰ্ভেচনৰ বাবে স্কেলপেল ব্যৱহাৰ কৰি ৰোগীৰ টিউমাৰৰ নমুনাটো যান্ত্ৰিকভাৱে পচি তাৰ পিছত ১০০ মাইক্ৰন ফিল্টাৰৰ মাজেৰে ঠেলি দি একক কোষৰ স্থলবন্দী লাভ কৰা হয়। ৰোগীৰ জলসিঞ্চন ১৫০০ আৰ পি এমত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰি কোষবোৰক পেলেট কৰি তলৰ পৰা ওলোৱা পানী আঁতৰাই পেলোৱা হৈছিল। টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ পৰা পোৱা কোষবোৰ ৫০% তাপ নিষ্ক্ৰিয় মানৱ এ বি ছিৰাম (চিগমা-এলড্ৰিচ), ৪০% আৰ পি এম আই-১৬৪০ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) আৰু ১০% ডাইমিথাইল ছালফক্সাইডত ক্ৰাইঅ’প্ৰিজাৰ্ভ কৰা হৈছিল। এই সংৰক্ষিত একক কোষৰ স্থলবন্দীবোৰ গলি যোৱা হৈছিল আৰু তলত বৰ্ণনা কৰা বিপাকীয় বিজ্ঞান আৰু বিপাকীয় পদাৰ্থ নিৰ্ণয়ৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল।
সম্পূৰ্ণ মাধ্যমটো ০.২২ মাইক্ৰ’মিটাৰ ফিল্টাৰ কৰা ৫০:৫০ পৰিপূৰক আৰপিএমআই ১৬৪০: এইমভিৰে গঠিত। আৰ পি এম আই ১৬৪০ + ২.০৫ মিলিমিটাৰ এল-গ্লুটামাইন (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ১০% তাপ-নিষ্ক্ৰিয় মানৱ এ বি ছিৰাম (চিগমা-এলড্ৰিচ), ১২.৫ মিলিমিটাৰ হেপেছ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক), ২ মিলিমিটাৰ এল-গ্লুটামাইন (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ফিচাৰ চাইন্টিফিক), ১ x পেনিচিলিন ষ্ট্ৰেপ্ট’মাইচিন (পেনষ্ট্ৰেপ) দ্ৰৱ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) আৰু ৫০ μMB-মাৰ্কেপ্ট’ইথানল। AimV (Invitrogen) ৰ পৰিপূৰক হিচাপে ২০ মিলিমিটাৰ হেপেছ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) আৰু ২ মিলিমিটাৰ এল-গ্লুটামাইন (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) দিয়া হয়। ফ্ল’ চাইট’মিটাৰ ষ্টেইনিং বাফাৰত ০.২২μm ফিল্টাৰ কৰা ফছফেট বাফাৰযুক্ত চেলাইন (PBS; Invitrogen) আছিল আৰু ইয়াৰ পৰিপূৰক আছিল ৩% তাপ-নিষ্ক্ৰিয় এবি মানৱ ছিৰাম (চিগমা)। কোষ সমৃদ্ধি বাফাৰটো ০.২২মাইক্ৰ’মিটাৰ ফিল্টাৰ কৰা পিবিএছৰ দ্বাৰা গঠিত আৰু ০.৫% তাপ-নিষ্ক্ৰিয় মানৱ এবি ছিৰাম (চিগমা-এলড্ৰিচ)ৰ সৈতে পৰিপূৰক।
৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ সম্পূৰ্ণ মাধ্যমত কোষবোৰক ১০ এন এম এম টি ডি আৰ আৰু ১০০ মাইক্ৰ’মিটাৰ ২-এন বি ডি জিৰে ৩০ মিনিটৰ বাবে ৰং কৰা হৈছিল। ইয়াৰ পিছত কোষবোৰক ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিটৰ বাবে জীৱনমুখী ৰং eF506 ৰে ৰং কৰা হ’ল। কোষবোৰ এফ চি ব্লক (ইবায়’ছায়েন্স) আৰু ব্রিলিয়েণ্ট ষ্টেইন বাফাৰ (বি ডি বায়’ছায়েন্সেছ)ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি, ফ্ল’ চাইট’মিটাৰ ষ্টেইনিং বাফাৰত পাতল কৰি (নিৰ্মাতাৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰি) আৰু কোঠাৰ উষ্ণতাত ১০ মিনিট ইনকিউবেট কৰক। কোষবোৰক ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২০ মিনিটৰ বাবে ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰি ষ্টেইনিং বাফাৰত এন্টিব’ডিৰ এটা গোট (তালিকা S2) ৰে ৰং কৰক। বিশ্লেষণৰ পূৰ্বে কোষবোৰক ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰি ষ্টেইনিং বাফাৰ (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R কনফিগাৰেচন)ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰক। কোষ গণনা তথ্য বিশ্লেষণ কৰিবলে SpectroFlo আৰু FlowJo V10 ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু তথ্য সৃষ্টি কৰিবলে GraphPad Prism 8 ব্যৱহাৰ কৰক। 2-NBDG আৰু MT DR ৰ মধ্যম প্ৰতিসৰণ তীব্ৰতা (MFI) লগ-নৰ্মালাইজ কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত মিল থকা ৰোগীৰ হিচাপ দিবলৈ পৰিসংখ্যা বিশ্লেষণৰ বাবে এটা যোৰযুক্ত t পৰীক্ষা ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। বিশ্লেষণৰ পৰা ৪০টাতকৈ কম পৰিঘটনা থকা সকলো জনসংখ্যা আঁতৰাই পেলোৱা; পৰিসংখ্যা বিশ্লেষণ আৰু তথ্য দৃশ্যায়ন কৰাৰ আগতে যিকোনো ঋণাত্মক মানৰ বাবে এটা MFI মান 1 সুমুৱাওক।
ওপৰৰ প্ৰক্ৰিয়া পেনেলৰ মেনুৱেল গেটিং কৌশল পৰিপূৰক হ'বলৈ আমি FlowJo ত মৃত কোষ আঁতৰোৱাৰ পিছত জনসংখ্যাত কোষসমূহ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে নিযুক্ত কৰিবলৈ আকৃতি নিষেধাজ্ঞা গছ (FAUST) (21) দ্বাৰা সম্পূৰ্ণ টীকা ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ। আমি নিজেই আউটপুট পৰিচালনা কৰি ভুল আবণ্টন কৰা যেন লগা জনসংখ্যা (PD1+ক পিডি১-টিউমাৰ কোষৰ সৈতে সংযুক্ত কৰি) আৰু ধৰি ৰখা জনসংখ্যাক একত্ৰিত কৰোঁ। প্ৰতিটো নমুনাত গড়ে ২%তকৈ অধিক কোষ থাকে, মুঠ ১১টা জনসংখ্যাৰ বাবে।
লিউকোচাইট পৃথকীকৰণ সামগ্ৰী (STEMCELL Technologies)ৰ পৰা পিবিএমচি পৃথক কৰিবলৈ ফিকল গ্ৰেডিয়েণ্ট ঘনত্ব কেন্দ্ৰচালিত ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। CD8 MicroBeads (Miltenyi) ব্যৱহাৰ কৰি PBMC ৰ পৰা CD8 + T কোষ পৃথক কৰা হৈছিল আৰু প্ৰস্তুতকাৰকৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰি TransAct (Miltenyi) ব্যৱহাৰ কৰি সম্পূৰ্ণ মাধ্যমত ২ সপ্তাহৰ বাবে প্ৰসাৰিত কৰা হৈছিল। আই এল-৭ (১০ এন জি/মিলিলিটাৰ; পেপ্ৰ’টেক) যুক্ত সম্পূৰ্ণ মাধ্যমত কোষবোৰক ৫ দিন থিয় হ’বলৈ দিয়া হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ট্ৰেন্সএক্টৰ দ্বাৰা পুনৰ উদ্দীপিত কৰা হৈছিল। ৭ম দিনত প্ৰস্তুতকাৰকৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰি একেৰাহে তিনিটা ৰাউণ্ডত কোষ সমৃদ্ধ কৰিবলৈ মানৱ চিডি৪৫ মাইক্ৰ’বিড (মিলটেনি) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। কোষবোৰক ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰি বিশ্লেষণৰ বাবে (ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে) এলিক’ট কৰা হৈছিল, আৰু এল চি-এম এছ/এম এছ বিশ্লেষণৰ বাবে ১০ লাখ কোষক তিনিবাৰ এলিক’ট কৰা হৈছিল। তলত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে নমুনাবোৰ LC-MS/MS দ্বাৰা প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰা হৈছিল। আমি ১০০০ আয়ন সংখ্যাৰে হেৰাই যোৱা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ মান অনুমান কৰিলোঁ। প্ৰতিটো নমুনাক মুঠ আয়ন সংখ্যা (TIC) দ্বাৰা স্বাভাৱিক কৰা হয়, লগাৰিদমিকভাৱে ৰূপান্তৰিত কৰা হয় আৰু বিশ্লেষণৰ পূৰ্বে MetaboAnalystR ত স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে স্বাভাৱিক কৰা হয়।
প্ৰতিজন ৰোগীৰ একক কোষৰ স্থলবন্দী গলি ৪০ মাইক্ৰ’মিটাৰ ফিল্টাৰেৰে সম্পূৰ্ণ মাধ্যমত ফিল্টাৰ কৰা হৈছিল (ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে)। প্ৰস্তুতকাৰকৰ প্ৰট’কল অনুসৰি চিডি৮+, চিডি৪+ আৰু চিডি৪৫- কোষৰ বাবে নমুনা সমৃদ্ধ কৰিবলৈ মাইক্ৰ’বিডছ (মিলটেনি) ব্যৱহাৰ কৰি চুম্বকীয় গুটি পৃথকীকৰণৰ দ্বাৰা একেৰাহে তিনিটা ৰাউণ্ডৰ ধনাত্মক নিৰ্বাচন ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। মুঠতে কোষবোৰক কোষ সমৃদ্ধি বাফাৰত (ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে) পুনৰ স্থলবন্দী কৰি গণনা কৰা হয়। কোষবোৰক মানৱ চিডি৮ বিড, মানৱ চিডি৪ বিড বা মানৱ চিডি৪৫ বিড (মিলটেনি)ৰ সৈতে ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিট ইনকিউবেট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত কোষ সমৃদ্ধি বাফাৰেৰে ধুই পেলোৱা হৈছিল। নমুনাটো এল এছ স্তম্ভ (মিলটেনি)ৰ মাজেৰে পাৰ কৰা হয়, আৰু ধনাত্মক আৰু ঋণাত্মক ভগ্নাংশ সংগ্ৰহ কৰা হয়। তাৰ পিছত CD4+ সমৃদ্ধিৰ দ্বিতীয় ৰাউণ্ডৰ বাবে CD8-ভগ্নাংশটো ব্যৱহাৰ কৰা হয় আৰু পৰৱৰ্তী CD45-সমৃদ্ধিৰ বাবে CD4-ভগ্নাংশটো ব্যৱহাৰ কৰা হয়। গোটেই পৃথকীকৰণ প্ৰক্ৰিয়াটোত দ্ৰৱটো বৰফৰ ওপৰত ৰাখিব লাগে।
বিপাকীয় পদাৰ্থ বিশ্লেষণৰ বাবে নমুনা প্ৰস্তুত কৰিবলৈ কোষবোৰ বৰফৰ দৰে ঠাণ্ডা নিমখৰ দ্ৰৱণেৰে এবাৰ ধুই প্ৰতিটো নমুনাত ১ মিলিলিটাৰ ৮০% মিথানল যোগ কৰা হৈছিল, তাৰ পিছত ভৰটেক্স কৰি তৰল নাইট্ৰজেনত স্নেপ ফ্ৰ’জেন কৰা হৈছিল। নমুনাবোৰক তিনিটা ফ্ৰীজ-থাউ চক্ৰৰ বলি কৰা হৈছিল আৰু ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিটৰ বাবে ১৪,০০০ আৰ পি এমত কেন্দ্ৰচালিত কৰা হৈছিল। বিপাকীয় পদাৰ্থ থকা চুপাৰনেটেণ্টটো শুকান হোৱালৈকে বাষ্পীভৱন কৰা হয়। বিপাকীয় পদাৰ্থবোৰ ৫০ μl ০.০৩% ফৰ্মিক এচিডত পুনৰ দ্ৰৱীভূত কৰি ভৰটেক্স কৰি মিহলি কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত কেন্দ্ৰচালিত কৰি ধ্বংসাৱশেষ আঁতৰোৱা হৈছিল।
ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে বিপাকীয় পদাৰ্থ নিষ্কাশন কৰক। মেটাব’ল’মিক্স গৱেষণাৰ বাবে চুপাৰনেটেণ্টক উচ্চ কাৰ্যক্ষম তৰল ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী বটললৈ স্থানান্তৰিত কৰক। বেচৰ প্ৰভাৱ ৰোধ কৰিবলৈ প্ৰতিটো নমুনাক একে সংখ্যক কোষেৰে চিকিৎসা কৰিবলৈ এটা ৰেণ্ডম ট্ৰিটমেণ্ট প্ৰট’কল ব্যৱহাৰ কৰক। আমি AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ত পূৰ্বে প্ৰকাশিত গ্লোবেল বিপাকীয় পদাৰ্থৰ গুণগত মূল্যায়ন কৰিলোঁ। ক্ৰ'মেট'গ্ৰাফিক বিশ্লেষণ আৰু শিখৰ এলেকা সংহতি মাল্টিকোৱাণ্ট সংস্কৰণ ২.১ চফ্টৱেৰ (এপ্লাইড বায়'চিষ্টেমছ SCIEX) ব্যৱহাৰ কৰি সম্পন্ন কৰা হৈছিল।
অনুপস্থিত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ মান অনুমান কৰিবলৈ ১০০০ আয়ন গণনা ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল আৰু প্ৰতিটো নমুনাৰ টিআইচি ব্যৱহাৰ কৰি নমুনা প্ৰক্ৰিয়াকৰণৰ পৰা যন্ত্ৰগত বিশ্লেষণৰ দ্বাৰা প্ৰৱৰ্তিত পৰিৱৰ্তনৰ বাবে সংশোধন কৰিবলৈ প্ৰতিটো ধৰা পৰা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ স্বাভাৱিক শিখৰ ক্ষেত্ৰফল গণনা কৰা হৈছিল। TIC স্বাভাৱিক কৰাৰ পিছত, MetaboAnalystR(51) (অবিকল্পিত প্ৰাচল) লগাৰিদমিক ৰূপান্তৰ আৰু স্বয়ংক্ৰিয় নৰ্ম লাইন স্কেলিঙৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয়। আমি নমুনাৰ প্ৰকাৰৰ মাজত মেটাব'ল'মৰ পাৰ্থক্যৰ অন্বেষণমূলক বিশ্লেষণ কৰিবলৈ ভেগান আৰ পেকেজৰ সৈতে পিচিএ ব্যৱহাৰ কৰিছিলোঁ, আৰু ৰোগী বিশ্লেষণ কৰিবলৈ আংশিক অতিৰিক্ততা বিশ্লেষণ ব্যৱহাৰ কৰিছিলোঁ। নমুনাৰ মাজৰ ইউক্লিডীয় দূৰত্ব গোট খুৱাবলৈ হিট মেপ ডেণ্ড্ৰগ্ৰাম নিৰ্মাণ কৰিবলৈ ৱাৰ্ড পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰক। আমি সমগ্ৰ কোষৰ প্ৰকাৰ আৰু অণুপৰিৱেশত ভিন্নভাৱে প্ৰচুৰ বিপাকীয় পদাৰ্থ চিনাক্ত কৰিবলৈ মানক বিপাকীয় পদাৰ্থৰ প্ৰাচুৰ্য্যৰ ওপৰত লিমা (৫২) ব্যৱহাৰ কৰিছিলোঁ। ব্যাখ্যাটো সৰল কৰিবলৈ আমি মডেলটো নিৰ্দিষ্ট কৰিবলৈ গোটৰ গড় প্ৰাচল ব্যৱহাৰ কৰো, আৰু অণুপৰিৱেশত থকা কোষৰ প্ৰকাৰসমূহক প্ৰতিটো গোট হিচাপে বিবেচনা কৰোঁ (n = ৬টা গোট); লিমা ডিজাইনত ৰোগীক বাধা হিচাপে অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হৈছিল। বিভিন্ন ৰোগীৰ মাজত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ পাৰ্থক্য পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি ৰোগীকে ধৰি লিমা মডেলটো নিৰ্দিষ্টভাৱে সামঞ্জস্য কৰিলোঁ। আমি কোষৰ প্ৰকাৰ আৰু Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg সংশোধন) ৰ অণুপৰিৱেশৰ মাজত পূৰ্বনিৰ্ধাৰিত বৈপৰীত্যৰ তাৎপৰ্য্য ৰিপৰ্ট কৰিছো।
তাৰ পিছত 10x 5′জিন এক্সপ্ৰেচন প্ৰট’কল ব্যৱহাৰ কৰি মুঠ জীৱন্ত ফ্ৰ’জেন এচিট আৰু টিউমাৰৰ নমুনাৰ ওপৰত একক-কোষ ট্ৰেন্সক্ৰিপ্টম ক্ৰমবিন্যাস কৰা হৈছিল। টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ মিল থকা পাঁচটা ক্ষেত্ৰ বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল যদিও এটা টিউমাৰৰ নমুনাৰ পৰা কম জীৱন ধাৰণ ক্ষমতাই ইয়াক অন্তৰ্ভুক্ত কৰাত বাধা দিছিল। ৰোগীৰ একাধিক নিৰ্বাচন লাভ কৰিবলৈ আমি ১০x ক্ৰ’মিয়াম নিয়ন্ত্ৰকৰ লেনত প্ৰতিজন ৰোগীৰ নমুনা একত্ৰিত কৰিলোঁ, আৰু জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰৰ স্থান পৃথকে পৃথকে বিশ্লেষণ কৰিলোঁ। ক্ৰমবিন্যাসৰ পিছত [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp যোৰযুক্ত শেষ (PE), ক্যুবেক জিনম; টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ বাবে প্ৰতিটো কোষত গড়ে ৭৩,৪৮৮ আৰু ৪১,৩৭৮টা পঢ়া]], আমি CellSNP আৰু Vireo (৫৩) ব্যৱহাৰ কৰিছিলোঁ (CelSNPৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি কাৰণ GRCh38 দ্বাৰা প্ৰদান কৰা সাধাৰণ মানৱ SNP (VCF)ক এটা দাতাৰ পৰিচয় নিযুক্ত কৰা হৈছে। এই কামৰ ভিত্তিত আমি টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনত প্ৰচুৰ কোষ প্ৰতিনিধিত্বৰ সৈতে তিনিটা ক্ষেত্ৰ ধৰি ৰাখিলোঁ (55) আৰু scran (56) বায়'কণ্ডাক্টৰ পেকেজিং, এইটোৱে 697 কোষ উৎপন্ন কৰিলে টিউমাৰ আৰু জলসিঞ্চনৰ পৰা ক্ৰমে ২৭৯২ আৰু ৪১৮৩টা কোষ) বিশ্লেষণৰ বাবে আমি আইগ্ৰাফৰ (৫৭) লৌভেন ক্লাষ্টাৰিং ব্যৱহাৰ কৰো CD8A আৰু GZMA ৰ প্ৰকাশৰ দ্বাৰা সংজ্ঞায়িত, কম ৰাইব'জ'ম প্ৰ'টিন প্ৰকাশৰ সৈতে subclusters বাদ দি আমি তেওঁলোকৰ t-SNE এম্বেডিং সহ, ইমিউন কোষ মাৰ্কাৰ আৰু NNMT প্ৰকাশৰ মাজত প্ৰকাশ অভাৰলেপ নিয়ন্ত্ৰণ কৰিব পাৰে.
লিউকোচাইট পৃথকীকৰণ সামগ্ৰী (STEMCELL Technologies)ৰ পৰা পিবিএমচিক ফিকল গ্ৰেডিয়েণ্ট ডেনচিটি চেণ্ট্ৰিফিউগেচনৰ দ্বাৰা পৃথক কৰা হৈছিল। CD3 বিড (Miltenyi) ব্যৱহাৰ কৰি PBMC ৰ পৰা CD3 + কোষ পৃথক কৰা হৈছিল। এম এন এৰ উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিত চি ডি ৩+ কোষক প্লেট-বাউণ্ড চি ডি ৩ (৫μg/ml), দ্ৰৱণীয় চি ডি ২৮ (৩μg/ml) আৰু আই এল-২ (৩০০ ইউ/মিলিলিটাৰ; প্ৰলিউকিন)ৰ দ্বাৰা সক্ৰিয় কৰা হৈছিল। সম্প্ৰসাৰণৰ শেষৰ দিনটোত ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ দ্বাৰা জীৱন ধাৰণ ক্ষমতা (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) আৰু প্ৰসাৰ (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) মূল্যায়ন কৰা হৈছিল। 4 ঘণ্টাৰ বাবে গলজিষ্টপৰ সৈতে PMA (20 ng/ml) আৰু ionomycin (1μg/ml) কোষক উদ্দীপিত কৰি ইফেক্টৰৰ কাৰ্য্যৰ মূল্যায়ন কৰা, আৰু CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) আৰু TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) নিৰীক্ষণ কৰা। qPCR আৰু ChIP কোষক PMA (20 ng/ml) আৰু ionomycin (1μg/ml) দ্বাৰা 4 ঘণ্টাৰ বাবে উদ্দীপিত কৰক। ELISA চুপাৰনেটেণ্ট PMA (20 ng/ml) আৰু ionomycin (1 μg/ml) দ্বাৰা 4 ঘণ্টা ধৰি উদ্দীপনা দিয়াৰ আগতে আৰু পিছত সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ব্যৱহাৰ কৰি RNA পৃথক কৰিবলৈ প্ৰস্তুতকাৰকৰ প্ৰট'কল অনুসৰণ কৰক। নমুনাটো একাকাৰ কৰিবলৈ QIAshredder (QIAGEN) ব্যৱহাৰ কৰক। পৰিপূৰক ডি এন এ (cDNA) সংশ্লেষণ কৰিবলৈ উচ্চ ক্ষমতাসম্পন্ন RNA to cDNA কিট (Thermo Fisher Scientific) ব্যৱহাৰ কৰক। তলত দিয়া প্ৰ'বসমূহৰ সৈতে জিন প্ৰকাশৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰিবলৈ (নিৰ্মাতাৰ প্ৰট'কল অনুসৰি) TaqMan ৰেপিড এডভান্সড মাষ্টাৰ মিক্স (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ব্যৱহাৰ কৰক: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [গ্লিচাৰেলডিহাইড-3-ফছফেট অফ হাইড্ৰজেন (GAPDH)] আৰু Hs01010726_m1 (SLC22A2)। নমুনাসমূহ মাইক্ৰ’এম্প অপটিকেল ফিল্মৰ সৈতে মাইক্ৰ’এম্প ফাষ্ট অপটিকেল ৯৬-ৱেল ৰিয়েকচন প্লেট (এপ্লাইড বায়’চিষ্টেমছ)ত ষ্টেপৱানপ্লাছ ৰিয়েল-টাইম পিচিআৰ চিষ্টেম (এপ্লাইড বায়’চিষ্টেমছ) (এপ্লাইড বায়’চিষ্টেমছ)ত চলোৱা হৈছিল। 35 অতিক্ৰম কৰা যিকোনো Ct মান ধৰা পেলোৱা থ্ৰেছহ'ল্ডৰ ওপৰত বুলি ধৰা হয় আৰু ধৰা নপৰা হিচাপে চিহ্নিত কৰা হয়।
পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা ধৰণে ChIP সম্পাদন কৰক (58)। মুঠতে কোষবোৰক ফৰ্মেলডিহাইড (চূড়ান্ত ঘনত্ব ১.৪২%) দ্বাৰা শোধন কৰি কোঠাৰ উষ্ণতাত ১০ মিনিট ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। 10 মিনিটৰ বাবে বৰফৰ ওপৰত পৰিপূৰক ফুলা বাফাৰ (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl আৰু 0.1% NP-40) ব্যৱহাৰ কৰক, তাৰ পিছত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে ইমিউন'প্ৰেচিপিটেচন বাফাৰত পুনৰ স্থলবন্দী কৰক (58)। তাৰ পিছত নমুনা নিম্নলিখিত চক্ৰৰ সৈতে sonicated কৰা হৈছিল: 10 চক্ৰ (20 1-ছেকেণ্ড পালছ) আৰু 40 ছেকেণ্ডৰ এটা স্থিতিশীল সময়. চিআইপি-গ্ৰেড ইমিউন’গ্ল’বিউলিন জি (চেল চিগনেলিং টেকন’লজি; ১μl), হিষ্টন এইচ৩ (চেল চিগনেলিং টেকন’লজি; ৩μl), এনএফএটি (ইনভিট্ৰজেন; ৩μl) আৰু এছপি১ (চেল চিগনেলিং টেকন’লজি; ৩μl) এন্টিব’ডিক নমুনাৰ সৈতে ৪°চিচি শ্বেকত ৰাতিটোৰ বাবে ইনকিউবেট কৰক। প্ৰটিন এ বিড (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) নমুনাৰ সৈতে ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১ ঘণ্টা ধৰি লাহে লাহে জোকাৰি ৰাখি ইনকিউবেট কৰক, তাৰ পিছত ডি এন এ সমৃদ্ধ কৰিবলৈ চেলেক্স বিড (বায়’-ৰেড) ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু প্ৰটিন হজমৰ বাবে প্ৰটিনেজ কে (থাৰ্মো ফিচাৰ) ব্যৱহাৰ কৰক। টিএনএফএ প্ৰ’ম’টাৰক পিচিআৰৰ দ্বাৰা ধৰা পেলোৱা হৈছিল: আগলৈ, জিজিজি টেট চিচিটি টিজিএ টিজিচি টিটিজি টিজিটি; ইয়াৰ বিপৰীতে জিটিজি চিচিএ এচিএ এচিটি জিচিচি টিটিটি এটিএ টিজি (২০৭-বিপি প্ৰডাক্ট)। ইমেজ লেব (বায়’-ৰেড)ৰ দ্বাৰা ছবিসমূহ প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল আৰু ইমেজজে চফট্ ৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল।
কোষ সংস্কৃতিৰ চুপাৰনেটেণ্ট ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল। মানৱ TNFα ELISA কিট (Invitrogen), মানৱ IL-2 ELISA কিট (Invitrogen) আৰু মানৱ IFN-γ ELISA কিট (Abcam)ৰ প্ৰস্তুতকাৰকৰ পদ্ধতি অনুসৰি নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল। প্ৰস্তুতকাৰকৰ প্ৰট’কল অনুসৰি চুপাৰনেটেণ্টক ১:১০০ পাতল কৰি TNFα আৰু IL-2 ধৰা পেলোৱা হৈছিল, আৰু ১:৩ পাতল কৰি IFN-γ ধৰা পেলোৱা হৈছিল। 450 nm ত শোষণ ক্ষমতা জুখিবলৈ EnVision 2104 মাল্টিলেবেল ৰিডাৰ (PerkinElmer) ব্যৱহাৰ কৰক।
লিউকোচাইট পৃথকীকৰণ সামগ্ৰী (STEMCELL Technologies)ৰ পৰা পিবিএমচিক ফিকল গ্ৰেডিয়েণ্ট ডেনচিটি চেণ্ট্ৰিফিউগেচনৰ দ্বাৰা পৃথক কৰা হৈছিল। CD3 বিড (Miltenyi) ব্যৱহাৰ কৰি PBMC ৰ পৰা CD3 + কোষ পৃথক কৰা হৈছিল। এম এন এৰ উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিত চি ডি ৩+ কোষক প্লেট-বাউণ্ড চি ডি ৩ (৫μg/ml), দ্ৰৱণীয় চি ডি ২৮ (৩μg/ml) আৰু আই এল-২ (৩০০ ইউ/মিলিলিটাৰ; প্ৰলিউকিন)ৰ সৈতে ৩ দিনৰ বাবে সক্ৰিয় কৰা হৈছিল। ৩ দিনৰ পিছত কোষবোৰ সংগ্ৰহ কৰি ০.৯% চেলাইনেৰে ধুই পেলেটটো স্নেপ ফ্ৰ’জেন কৰা হ’ল। 123count eBeads ব্যৱহাৰ কৰি ফ্ল' চাইট'মেট্ৰি (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R কনফিগাৰেচন) দ্বাৰা কোষ গণনা কৰা হৈছিল।
ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে বিপাকীয় পদাৰ্থ নিষ্কাশন কৰক। শুকান নিষ্কাশনটো ৪০০০ কোষ সমতুল্য/μl ঘনত্বত পুনৰ গঠন কৰা হৈছিল। ৰিভাৰ্ছড-ফেজ ক্ৰ'মাট'গ্ৰাফী (১২৯০ ইনফিনিটি II, এজিলেণ্ট টেকন'লজিছ, চান্টা ক্লাৰা, কে.এ.) আৰু কৰ্টেকছ টি ৩ কলাম (২.১×১৫০ মিলিমিটাৰ, কণিকাৰ আকাৰ ১.৬-মাইক্ৰ'মিটাৰ, ছিদ্ৰৰ আকাৰ ১২০-এ; #১৮৬০০৮৫০০, ৱাটাৰ্ছ) দ্বাৰা নমুনা বিশ্লেষণ কৰা। মেৰু গণ বৰ্ণালীমাপক (৬৪৭০, এজিলেণ্ট), য’ত ইলেক্ট্ৰ’স্প্ৰে আয়নীয়কৰণ ধনাত্মক অৱস্থাত কাম কৰে। চলন্ত পৰ্যায় A ০.১% ফৰ্মিক এচিড (H2O ত), চলন্ত পৰ্যায় B ৯০% এচিট’নাইট্ৰাইল, ০.১% ফৰ্মিক এচিড। LC গ্ৰেডিয়েণ্ট ১০০% A ৰ বাবে ০ৰ পৰা ২ মিনিট, ৯৯% B ৰ বাবে ২ৰ পৰা ৭.১ মিনিট, আৰু ৯৯% B ৰ বাবে ৭.১ৰ পৰা ৮ মিনিট। তাৰ পিছত স্তম্ভটোক চলন্ত পৰ্যায় A ৰ সৈতে ০.৬ মিলিলিটাৰ/মিনিট প্ৰবাহৰ হাৰত ৩ মিনিটৰ বাবে পুনৰ সমতা স্থাপন কৰক। . প্ৰবাহৰ হাৰ ০.৪মিলিলিটাৰ/মিনিট, আৰু স্তম্ভ কক্ষটো ৫০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছলৈ গৰম কৰা হয়। ৰিটেনচন টাইম (RT) আৰু ৰূপান্তৰ (RT = 0.882 মিনিট, ৰূপান্তৰ 1 = 137→94.1, ৰূপান্তৰ 2 = 137→92 , ৰূপান্তৰ 3 = 137→78) স্থাপন কৰিবলৈ MNA ৰ বিশুদ্ধ ৰাসায়নিক মানদণ্ড (M320995, টৰন্টো ৰিচাৰ্চ কেমিকেল কোম্পানী, নৰ্থ ইয়ৰ্ক, অন্টাৰিঅ', কানাডা) ব্যৱহাৰ কৰক। যেতিয়া তিনিওটা পৰিৱৰ্তন সঠিক ধৰি ৰখা সময়ত ঘটে, তেতিয়া নিৰ্দিষ্টতা নিশ্চিত কৰিবলৈ পৰিমাণ নিৰ্ণয়ৰ বাবে পৰিৱৰ্তন ১ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। ষ্টক দ্ৰৱৰ (১ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ) ছটা ক্ৰমিক পাতল কৰি এমএনএ (টৰন্টো ৰিচাৰ্চ কেমিকেল কোম্পানী)ৰ মানক বক্ৰ সৃষ্টি কৰি ক্ৰমে ০.১, ১.০, ১০ আৰু ১০০ এনজি/মিলিলিটাৰ আৰু ১.০ আৰু ১০মাইক্ৰ’গ্ৰাম/মিলিলিটাৰ তৰল মান লাভ কৰা হৈছিল। ধৰা পেলোৱাৰ সীমা ১ ng/ml, আৰু ৰৈখিক সঁহাৰি ১০ ng/ml আৰু ১০μg/mlৰ ভিতৰত। দুটা মাইক্ৰ'লিটাৰ নমুনা আৰু মানদণ্ডৰ প্ৰতিটো বেজী এল চি/এম এছ বিশ্লেষণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয়, আৰু বিশ্লেষণ মঞ্চৰ স্থিৰতা নিশ্চিত কৰিবলৈ প্ৰতি আঠটা বেজীৰ মূৰে মূৰে এটা মিশ্ৰিত গুণগত নিয়ন্ত্ৰণ নমুনা চলোৱা হয়। এম এন এ-চিকিৎসা কৰা সকলো কোষৰ নমুনাৰ এম এন এ সঁহাৰি পৰীক্ষাৰ ৰৈখিক পৰিসৰৰ ভিতৰত আছিল। তথ্য বিশ্লেষণ MassHunter পৰিমাণগত বিশ্লেষণ চফট্ ৱেৰ (v9.0, Agilent) ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হৈছিল।
দ্বিতীয় প্ৰজন্মৰ αFR-CAR নিৰ্মাণ Song et al. (৫৯)। মুঠতে, কনষ্ট্ৰাক্টটোত তলত দিয়া বিষয়বস্তুসমূহ থাকে: CD8a লিডাৰ ক্ৰম, মানৱ αFR-নিৰ্দিষ্ট একক-শৃংখল চলক খণ্ড, CD8a হিঞ্জ আৰু ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন অঞ্চল, CD27 আন্তঃকোষীয় ডমেইন আৰু CD3z আন্তঃকোষীয় ডমেইন। সম্পূৰ্ণ CAR ক্ৰমটো GenScript দ্বাৰা সংশ্লেষণ কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ট্ৰেন্সডাকচন কাৰ্যক্ষমতা মূল্যায়ন কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা GFP এক্সপ্ৰেচন কেছেটৰ ওপৰৰ দ্বিতীয় প্ৰজন্মৰ লেন্টিভাইৰেল এক্সপ্ৰেচন ভেক্টৰত ক্ল'ন কৰা হৈছিল।
লেন্টিভাইৰাছ HEK293T কোষৰ সংক্ৰমণৰ দ্বাৰা উৎপন্ন হয় [আমেৰিকান টাইপ কালচাৰ কলেকচন (ATCC); ডালবেকোৰ পৰিৱৰ্তিত ঈগল মাধ্যমত ১০% ভ্ৰুণৰ গৰুৰ ছিৰাম (FBS) আৰু ১% পেনষ্ট্ৰেপ যুক্ত কৰা হয় আৰু CAR-GFP ভেক্টৰ ব্যৱহাৰ কৰা হয় আৰু পেকেজিং প্লাজমিড (psPAX2 আৰু pMD2.G, Addgene)ত লিপ'ফেকচন এমাইন (Sigma-Aldrich) ব্যৱহাৰ কৰা হয়। ভাইৰাছযুক্ত চুপাৰনেটেণ্ট ট্ৰান্সফেকচনৰ ৪৮ আৰু ৭২ ঘণ্টাৰ পিছত সংগ্ৰহ কৰি ফিল্টাৰ কৰি আল্ট্ৰাচেণ্ট্ৰিফিউগেচনৰ দ্বাৰা ঘনীভূত কৰা হৈছিল। ঘন ভাইৰাছৰ চুপাৰনেটেণ্ট -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ট্ৰান্সডাকচন নোহোৱালৈকে সংৰক্ষণ কৰক।
পিবিএমচিক সুস্থ দাতা লিউকোচাইট পৃথকীকৰণ সামগ্ৰী (STEMCELL Technologies)ৰ পৰা ফিকল গ্ৰেডিয়েণ্ট ডেনচিটি চেণ্ট্ৰিফিউগেচনৰ দ্বাৰা পৃথক কৰা হয়। পিবিএমচিৰ পৰা চিডি৮+ কোষ পৃথক কৰিবলৈ ধনাত্মক নিৰ্বাচন চিডি৮ মাইক্ৰ’বিড (মিলটেনি) ব্যৱহাৰ কৰক। TransAct (Miltenyi) আৰু TexMACS মাধ্যমত [Miltenyi; ৩% তাপ-নিষ্ক্ৰিয় মানৱ ছিৰাম, ১% পেনষ্ট্ৰেপ আৰু আই এল-২ (৩০০ ইউ/মিলিলিটাৰ)ৰ সৈতে পৰিপূৰক। উদ্দীপনা দিয়াৰ ২৪ ঘণ্টাৰ পিছত টি কোষক লেন্টিভাইৰাছ (প্ৰতি ১০৬টা কোষত ১০ μl ঘন ভাইৰাছ চুপাৰনেটেণ্ট)ৰ দ্বাৰা ট্ৰান্সডুচ কৰা হৈছিল। 1 ৰ পৰা 3 দিনৰ পিছত Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) ত, কোষৰ GFP প্ৰকাশৰ মূল্যায়ন কৰি অন্ততঃ 30% ট্ৰেন্সডাকচন কাৰ্যক্ষমতা প্ৰদৰ্শন কৰক।
CAR-T কোষক নিম্নোক্ত অৱস্থাত Immunocult (STEMCELL Technologies; ১% PenStrep ৰ সৈতে পৰিপূৰক)ত ২৪ ঘণ্টা ধৰি সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল: অচিকিৎসা কৰা, ২৫০ μM এডিন'চিন বা ১০ mM MNA দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা। প্ৰিট্ৰিটমেণ্টৰ পিছত CAR-T কোষবোৰক PBS ৰে ধুই ২০,০০০ SK-OV-3 কোষৰ সৈতে সংযুক্ত কৰা হৈছিল [ATCC; 10% FBS আৰু 1% PenStrep ৰ সৈতে পৰিপূৰক হিচাপে মেককয় 5A মাধ্যমত (চিগমা-এলড্ৰিচ): 1 ৰ ইফেক্টৰ আৰু টাৰ্গেট অনুপাত পৰিপূৰক ইমিউন'কাল্ট মাধ্যমত তিনিবাৰকৈ বৃদ্ধি কৰা হৈছিল। ডিজিটেলিছ চেপনিন (০.৫ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ; চিগমা-এলড্ৰিচ) দ্বাৰা লাইজ কৰা এছ কে-অ’ভি-৩ কোষ আৰু এছ কে-অ’ভি-৩ কোষক ক্ৰমে ঋণাত্মক আৰু ধনাত্মক নিয়ন্ত্ৰণ হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ২৪ ঘণ্টা সহযোগী খেতি কৰাৰ পিছত চুপাৰনেটেণ্ট সংগ্ৰহ কৰি প্ৰস্তুতকাৰকৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰি লেক্টেট ডিহাইড্ৰ’জেনেজ (LDH) জুখিছিল (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega)। এল ডি এইচ চুপাৰনেটেণ্টক এল ডি এইচ বাফাৰত ১:৫০ পাতল কৰা হৈছিল। হত্যাৰ শতকৰা হাৰ তলত দিয়া সূত্ৰটো ব্যৱহাৰ কৰি জুখিছিল: হত্যাৰ শতাংশ = সংশোধনৰ শতাংশ / সৰ্বোচ্চ হত্যাৰ হাৰ x ১০০%, য'ত সংশোধনৰ শতাংশ = কেৱল সহ-সংস্কৃতি-টি কোষ, আৰু সৰ্বোচ্চ হত্যাৰ হাৰ = ধনাত্মক নিয়ন্ত্ৰণ-ঋণাত্মক নিয়ন্ত্ৰণ।
লিখনী বা সামগ্ৰী আৰু পদ্ধতিত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, পৰিসংখ্যা বিশ্লেষণৰ বাবে GraphPad Prism 8, Microsoft Excel বা R v3.6.0 ব্যৱহাৰ কৰক। যদি একেজন ৰোগীৰ পৰা একাধিক নমুনা সংগ্ৰহ কৰা হয় (যেনে জলসিঞ্চন আৰু টিউমাৰ), আমি যোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা ব্যৱহাৰ কৰো বা উপযুক্তভাৱে ৰোগীক ৰেণ্ডম ইফেক্ট হিচাপে ৰৈখিক বা সাধাৰণীকৃত মডেলত অন্তৰ্ভুক্ত কৰোঁ। মেটাব’ল’মিক্স বিশ্লেষণৰ বাবে গুৰুত্ব পৰীক্ষা তিনিবাৰকৈ কৰা হয়।
এই প্ৰবন্ধটোৰ বাবে পৰিপূৰক সামগ্ৰীৰ বাবে অনুগ্ৰহ কৰি http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 চাওক
এইটো ক্ৰিয়েটিভ কমন্স এট্ৰিবিউচন-নন-কমাৰ্চিয়েল লাইচেন্সৰ চৰ্ত অনুসৰি বিতৰণ কৰা এটা মুক্ত প্ৰৱেশৰ প্ৰবন্ধ, যিয়ে যিকোনো মাধ্যমত ব্যৱহাৰ, বিতৰণ আৰু প্ৰজনন কৰাৰ অনুমতি দিয়ে, যেতিয়ালৈকে চূড়ান্ত ব্যৱহাৰ বাণিজ্যিক লাভৰ বাবে নহয় আৰু ভিত্তিটো হ'ল যে মূল কামটো শুদ্ধ। সন্দৰ্ভ।
টোকা: আমি আপোনাক কেৱল আপোনাৰ ইমেইল ঠিকনা দিবলৈ কওঁ যাতে আপুনি পৃষ্ঠালৈ পৰামৰ্শ দিয়া ব্যক্তিজনে জানে যে আপুনি তেওঁলোকে ইমেইলটো চাব বিচাৰে আৰু ই স্পেম নহয়। আমি কোনো ইমেইল ঠিকনা ধৰিব নোৱাৰো।
এই প্ৰশ্নটো আপুনি দৰ্শক নেকি পৰীক্ষা কৰিবলৈ আৰু স্বয়ংক্ৰিয় স্পেম জমা দিয়া ৰোধ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
মাৰিছা কে কিলগ’ৰ (মাৰিছা কে কিলগ’ৰ), চাৰা মেকফাৰ্চন (ছাৰা মেকফাৰ্চন), লৰেন জি জাকাৰিয়াছ (লৰেন জি জাকাৰিয়াছ), এবিগেল এলি এৰিছ জি ৱাটছন (এইচ ৱাটছন), জন ষ্টেগ (জন ষ্টেগ), ব্ৰেড এইচ নেলছন (ব্ৰেড এইচ নেলছন), ৰালফ জে ডি বেলাৰ্ডিনি (ৰালফ জে ডিবেৰাৰ্ডিনিছ), ৰাছেল জি জোনছ (ৰাছেল জি জোনছ), ফিনিয়াছ টি হেমিল্টন (ফিনিয়াছ টি.
এম এন এয়ে টি কোষৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা দমনত অৰিহণা যোগায় আৰু মানৱ কৰ্কট ৰোগৰ চিকিৎসাৰ বাবে সম্ভাৱ্য ইমিউন’থেৰাপি লক্ষ্যক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে।
মাৰিছা কে কিলগ’ৰ (মাৰিছা কে কিলগ’ৰ), চাৰা মেকফাৰ্চন (ছাৰা মেকফাৰ্চন), লৰেন জি জাকাৰিয়াছ (লৰেন জি জাকাৰিয়াছ), এবিগেল এলি এৰিছ জি ৱাটছন (এইচ ৱাটছন), জন ষ্টেগ (জন ষ্টেগ), ব্ৰেড এইচ নেলছন (ব্ৰেড এইচ নেলছন), ৰালফ জে ডি বেলাৰ্ডিনি (ৰালফ জে ডিবেৰাৰ্ডিনিছ), ৰাছেল জি জোনছ (ৰাছেল জি জোনছ), ফিনিয়াছ টি হেমিল্টন (ফিনিয়াছ টি.
এম এন এয়ে টি কোষৰ প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা দমনত অৰিহণা যোগায় আৰু মানৱ কৰ্কট ৰোগৰ চিকিৎসাৰ বাবে সম্ভাৱ্য ইমিউন’থেৰাপি লক্ষ্যক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে।
©২০২১ আমেৰিকান এছ’চিয়েচন ফৰ দ্য এডভান্সমেণ্ট অৱ চাইন্স। সকলো অধিকাৰ সংৰক্ষিত। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef আৰু COUNTER ৰ অংশীদাৰ। চাইন্সএডভান্সছ আই এছ এছ এন ২৩৭৫-২৫৪৮।