কোষৰ বিভাজন আৰু হোমিঅ’ষ্টেছিছ বজাই ৰখাৰ বাবে নিঃসৰণ পথত প্ৰটিন সজাই পৰাই তোলাটো অতি প্ৰয়োজনীয়। খোলা-মধ্যস্থতাকাৰী সজাই পৰাই তোলাৰ উপৰিও নিঃসৰণ পৰিবহণৰ প্ৰক্ৰিয়াত কিনেচিন সজাই পৰাই লোৱাত লিপিডৰ ভূমিকা দীৰ্ঘদিনীয়া এটা মৌলিক প্ৰশ্ন যাৰ উত্তৰ এতিয়াও পোৱা হোৱা নাই। ইয়াত আমি 3D একেলগে বহুৰঙী উচ্চ-ৰিজ'লিউচন বাস্তৱ সময়ৰ ইমেজিং সম্পন্ন কৰি ইন ভিভ'ত প্ৰমাণ কৰোঁ যে অতি দীঘলীয়া চেৰামাইড লিপিড অংশৰ সৈতে নতুনকৈ সংশ্লেষিত গ্লাইকোচাইলফছফেটিডাইলিন'চিটল-স্থিৰ প্ৰ'টিনসমূহ ক্লাষ্টাৰ কৰা হয় আৰু বিশেষ এণ্ড'প্লাজমত শ্ৰেণীভুক্ত কৰা হয় নেট এক্সাইট চাইট, যিটো ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন প্ৰ'টিনৰ দ্বাৰা ব্যৱহাৰ কৰাতকৈ পৃথক। ইয়াৰ উপৰিও আমি দেখুৱাইছো যে এণ্ডোপ্লাজমিক ৰেটিকুলাম মেমব্ৰেনত থকা চেৰামাইডৰ শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্য এই ছৰ্টিং নিৰ্বাচনশীলতাৰ বাবে অতি গুৰুত্বপূৰ্ণ। আমাৰ অধ্যয়নে লিপিড শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি প্ৰটিন কাৰ্গোক নিঃসৰণ পথত নিৰ্বাচিত ৰপ্তানি স্থানত শ্ৰেণীভুক্ত কৰিবলৈ প্ৰথম প্ৰত্যক্ষ ইন ভিভ' প্ৰমাণ প্ৰদান কৰে।
ইউকেৰিয়াম কোষত এণ্ডোপ্লাজমিক ৰেটিকুলাম (ER)ত সংশ্লেষিত প্ৰটিনসমূহক পৰিবহণৰ সময়ত নিঃসৰণ পথৰ মাজেৰে ভাগ কৰি নিজৰ উপযুক্ত কোষীয় গন্তব্যস্থানলৈ প্ৰেৰণ কৰা হয় (১)। কোট-মধ্যস্থতাকাৰী সজাই পৰাই তোলাৰ উপৰিও দীৰ্ঘদিন ধৰি অনুমান কৰা হৈছিল যে কিছুমান লিপিডে নিৰ্দিষ্ট প্ৰটিনৰ দৰে নিৰ্দিষ্ট মেমব্ৰেন ডমেইনত ক্লাষ্টাৰ কৰি নিৰ্বাচিত প্ৰস্থান বিন্দু হিচাপেও কাম কৰিব পাৰে (২-৫)। কিন্তু এই সম্ভাৱ্য লিপিড ভিত্তিক ব্যৱস্থাটো প্ৰমাণ কৰিবলৈ এতিয়াও প্ৰত্যক্ষ ইন ভিভ’ প্ৰমাণৰ অভাৱ। এই মৌলিক সমস্যাটো সমাধানৰ বাবে আমি ঈষ্টত অধ্যয়ন কৰিলোঁ যে গ্লাইকোচাইলফছফেটিডাইলিন’চিটল (GPI) এংকৰ প্ৰ’টিন (GPI-APs) কেনেকৈ ই আৰৰ পৰা পৃথকভাৱে ৰপ্তানি কৰা হয়। জিপিআই-এপিসমূহ হৈছে বিভিন্ন ধৰণৰ লিপিড-সংযুক্ত কোষ পৃষ্ঠৰ প্ৰটিন ( 6, 7)। জিপিআই-এপি হৈছে গ্লাইকোলিপিড অংশ (জিপিআই এংকৰ)ৰ জৰিয়তে প্লাজমা পৰ্দাৰ বাহিৰৰ লিফলেটৰ সৈতে সংযুক্ত নিঃসৃত প্ৰটিন। তেওঁলোকে জিপিআই এংকৰক ই আৰ লুমেনত ৰক্ষণশীল অনুবাদৰ পিছৰ পৰিৱৰ্তন হিচাপে গ্ৰহণ কৰে (৮)। সংলগ্ন হোৱাৰ পিছত জিপিআই-এপি ই আৰৰ পৰা গলজি যন্ত্ৰ (৫, ৯)ৰ মাজেৰে প্লাজমা পৰ্দালৈ যায়। জিপিআই এংকৰৰ উপস্থিতিৰ ফলত জিপিআই-এপিক ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৃত প্ৰটিনৰ পৰা (অন্য প্লাজমা মেমব্ৰেন প্ৰটিনকে ধৰি) নিঃসৰণ পথৰ কাষেৰে পৃথকে পৰিবহণ কৰা হয় (৫, ৯, ১০)। ঈষ্ট কোষত জিপিআই-এপিসমূহক এণ্ডোপ্লাজমিক ৰেটিকুলামত থকা অন্যান্য নিঃসৃত প্ৰটিনৰ পৰা পৃথক কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত কোট প্ৰটিন কমপ্লেক্স II (COPII) দ্বাৰা মেৰিয়াই থোৱা অনন্য ভেচিকলত পেকেজ কৰা হয় (6, 7)। ই আৰ ৰপ্তানি প্ৰক্ৰিয়াত এই শ্ৰেণীবিভাজন প্ৰক্ৰিয়াৰ নিৰ্ণায়কসমূহ অস্পষ্ট, কিন্তু অনুমান কৰা হৈছে যে এই ব্যৱস্থাৰ বাবে লিপিডৰ প্ৰয়োজন হ'ব পাৰে, বিশেষকৈ জিপিআই এংকৰৰ লিপিড অংশৰ গাঁথনিগত পুনৰ নিৰ্মাণৰ প্ৰয়োজন হ'ব পাৰে (৫, ৮)। ঈষ্টত জিপিআই সংলগ্ন হোৱাৰ লগে লগে জিপিআই লিপিড পুনৰ নিৰ্মাণ আৰম্ভ হয় আৰু বহু ক্ষেত্ৰত ইয়াৰ ফলত চেৰামাইড ২৬ কাৰ্বন লং-চেইন চেচুৰেটেড ফেটি এচিড (চি২৬:০)ৰ সৈতে বান্ধ খায় (১১, ১২)। এতিয়ালৈকে ঈষ্ট কোষে উৎপাদন কৰা প্ৰধান চেৰামাইড হৈছে C26 ceramide। ইয়াক ই আৰত সংশ্লেষণ কৰা হয় আৰু ইয়াৰ বেছিভাগেই COPII ভেচিকলৰ জৰিয়তে গলজি যন্ত্ৰলৈ ৰপ্তানি কৰা হয় (13)। জিপিআই-এপিৰ ই আৰ ৰপ্তানিৰ বাবে বিশেষভাৱে চলি থকা চেৰামাইড সংশ্লেষণৰ প্ৰয়োজন হয় (১৪, ১৫), আৰু পাছলৈ, গলজি যন্ত্ৰত চেৰামাইডৰ ইনোচিটল ফছফেট চেৰামাইড (আইপিচি)লৈ ৰূপান্তৰ জিপিআই এংকৰ সংশ্লেষণৰ ওপৰত নিৰ্ভৰশীল (১৬)। কৃত্ৰিম পৰ্দাৰ সৈতে জৈৱ-ভৌতিক অধ্যয়নে দেখুৱাইছে যে অতি দীঘল এচিল শৃংখলৰ চেৰামাইড একত্ৰিত হৈ অনন্য ভৌতিক ধৰ্মৰ সৈতে ক্ৰমবদ্ধ ডমেইন গঠন কৰিব পাৰে (17, 18)। এই তথ্যসমূহে এই ধাৰণাটোলৈ লৈ যায় যে C26 চেৰামাইড আৰু C26 চেৰামাইডৰ সৈতে GPI-AP এ তুলনামূলকভাৱে অগোছাল ই আৰ মেমব্ৰেন লিপিড পৰিৱেশত শৃংখলাবদ্ধ অঞ্চল বা অঞ্চলত একত্ৰিত হ’বলৈ নিজৰ ভৌতিক ধৰ্ম ব্যৱহাৰ কৰে। ই মূলতঃ চুটি আৰু অসংপৃক্ত গ্লিচাৰলিপিড (C16:1 আৰু C18:1) (19, 20) দ্বাৰা গঠিত। এই অঞ্চলসমূহ নিৰ্বাচিতভাৱে নিৰ্দিষ্ট ই আৰ এক্সাইট ছাইট (ই আৰ ই এছ)ত মনোনিৱেশ কৰা হ'ব, য'ত চেৰামাইড আৰু চেৰামাইড-ভিত্তিক জিপিআই-এপি একেটা নিবেদিত ক'পিআইআই ভেচিকলত গলজিলৈ সহযোগীভাৱে পৰিবহণ কৰিব পাৰি (৫)।
এই অধ্যয়নত আমি এই লিপিড ভিত্তিক ব্যৱস্থাটো প্ৰত্যক্ষভাৱে পৰীক্ষা কৰিছো ছুপাৰ-ৰিজ’লিউচন কনফ’কেল ৰিয়েল-টাইম ইমেজিং মাইক্ৰস্কোপি (SCLIM) ব্যৱহাৰ কৰি, যিটো হৈছে এক অত্যাধুনিক মাইক্ৰস্কোপি কৌশল যিয়ে একেলগে ফ্লু’ৰেচেণ্ট লেবেলযুক্ত প্ৰ’টিন পৰ্যবেক্ষণ কৰিব পাৰে
আমি প্ৰথমে SCLIM প্ৰযুক্তি প্ৰয়োগ কৰিলোঁ যাতে S. cerevisiae ত ER এৰি যোৱাৰ পিছত C26 ceramide গ্ৰুপৰ সৈতে স্বাভাৱিক GPI-AP কেনেকৈ ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৃত প্ৰটিনৰ পৰা স্ক্ৰীন কৰা হয়। ER ৰ শ্ৰেণীবিভাজন পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি এটা জেনেটিক ব্যৱস্থা ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ যিয়ে প্ৰত্যক্ষভাৱে নতুনকৈ সংশ্লেষিত কাৰ্গো ইন ভিভ'ত ERESত প্ৰৱেশ কৰা দৃশ্যমান কৰিব পাৰে (7, 23)। কাৰ্গো হিচাপে আমি সেউজীয়া ফ্লু’ৰেচেণ্ট প্ৰটিন (GFP) আৰু ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৃত প্ৰটিন Mid2 নিয়াৰ-ইনফ্ৰাৰেড ফ্লু’ৰেচেণ্ট প্ৰ’টিন (iRFP) লেবেলযুক্ত C26 চেৰামাইড-ভিত্তিক GPI-AP Gas1 বাছি লৈছিলো, যি দুয়োটাই প্লাজমা মেমব্ৰেনক লক্ষ্য কৰি লৈছিল (24–26)। sec31-1 উষ্ণতা-সংবেদনশীল মিউটেণ্টত এই দুটা কাৰ্গো এটা গেলেক্ট’জ-প্ৰৰোচক প্ৰ’ম’টাৰ আৰু এটা গঠনমূলক ERES মাৰ্কাৰৰ অধীনত প্ৰকাশ কৰা হয়। চৰম উষ্ণতাত (৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ) কাৰণ sec31-1 মিউটেচনে COPII কোট উপাদান Sec31 ৰ কাৰ্য্যক প্ৰভাৱিত কৰি COPII অংকুৰণ আৰু ই আৰ ৰপ্তানি বাধা দিয়ে, নতুনকৈ সংশ্লেষিত সামগ্ৰী ER ত জমা হয় (23)। কম উষ্ণতালৈ (২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ) ঠাণ্ডা হোৱাৰ পিছত sec31-1 মিউটেণ্ট কোষবোৰ নিঃসৰণ অঞ্চলৰ পৰা উদ্ধাৰ হয় আৰু জমা হোৱা নতুন কৃত্ৰিম সামগ্ৰী ই আৰৰ পৰা ৰপ্তানি কৰিবলৈ আৰম্ভ কৰে। CLIM ভিজুৱেলাইজেচনে দেখুৱাইছে যে নতুনকৈ সংশ্লেষিত Gas1-GFP আৰু Mid2-iRFP ৰ বেছিভাগেই ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ইনকিউবেচন কৰাৰ পিছতো sec31-1 মিউটেণ্ট কোষৰ ই আৰত জমা হৈ থাকে আৰু তাৰ পিছত ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৫ মিনিটৰ বাবে মুকলি কৰি দিয়ে (চিত্ৰ ১)। যিহেতু Mid2-iRFP সমগ্ৰ ER মেমব্ৰেনত বিতৰণ কৰা হয়, আৰু Gas1-GFP অবিৰত ER মেমব্ৰেন এলেকাত ঘনীভূত আৰু গোট খোৱা হয়, গতিকে ইহঁতৰ বিতৰণ সম্পূৰ্ণ বেলেগ (চিত্ৰ 1, A ৰ পৰা C আৰু চলচ্চিত্ৰ S1)। ইয়াৰ উপৰিও, চিত্ৰ 1D ত দেখুওৱাৰ দৰে, Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰত Mid2-iRFP নাই। এই ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে জিপিআই-এপি আৰু ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন প্ৰটিনসমূহ আৰম্ভণিতে বিভিন্ন ই আৰ মেমব্ৰেন অঞ্চলত পৃথক কৰা হৈছিল। Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰ mCherry ৰ COPII কোট প্ৰটিন Sec13 (চিত্ৰ 1, E আৰু F, আৰু চলচ্চিত্ৰ S1) (23) দ্বাৰা লেবেল কৰা এটা নিৰ্দিষ্ট ERES ৰ কাষতে থাকে।
sec31-1 কোষে গেলেক্ট'জ-প্ৰৰোচিত নিঃসৰণ প্ৰকাশ কৰে, এটা দীঘল এচিল শৃংখল (C26) চেৰামাইড GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, সেউজীয়া) আৰু ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন প্ৰ'টিন Mid2-iRFP (TMP, নীলা) আৰু এই কনষ্ট্ৰাক্টিভ ERES লেবেলিং Sec13-mCherry (ERES, magenta) 37°C ত 30 মিনিটৰ বাবে ইনকিউবেট কৰা হৈছিল, স্থানান্তৰ কৰা হৈছিল ২৪°C, আৰু ৫ মিনিটৰ পিছত SCLIM দ্বাৰা ছবি তোলা। (A ৰ পৰা C) এটা সমতলৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক একত্ৰিত বা একক 2D ছবি (A), 10 z-অংশৰ এটা 2D প্ৰজেকচন ছবি (B) বা কাৰ্গো আৰু ERES মাৰ্কাৰৰ এটা 3D কোষ গোলাৰ্ধৰ ছবি (C) দেখুৱাইছে। স্কেল বাৰ ১μm (A আৰু B)। স্কেল একক ০.৫৫১μm (C)। Gas1-GFP বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চল বা ক্লাষ্টাৰত ধৰা পৰিছিল, আনহাতে Mid2-iRFP ধৰা পৰিছিল আৰু সমগ্ৰ ER মেমব্ৰেন (C) ত বিতৰণ কৰা হৈছিল। (D) গ্ৰাফটোৱে বগা কাঁড় ৰেখাৰ কাষেৰে Gas1-GFP আৰু Mid2-iRFP ৰ আপেক্ষিক প্ৰতিসৰণ তীব্ৰতা দেখুৱাইছে (বাওঁফালে)। AU, ইচ্ছাকৃত একক। (E আৰু F) য়ে সামগ্ৰী আৰু ERES চিহ্নক একত্ৰিত কৰা 3D ছবিখনক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। নিৰ্দিষ্ট ERES ৰ ওচৰত Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰ ধৰা পৰিছিল। স্কেল একক ০.৫৫১μm। (F) বগা কঠিন কাঁড় চিহ্নটোৱে ERES ৰ সৈতে জড়িত Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰক চিহ্নিত কৰে। মাজৰ আৰু সোঁফালৰ পেনেলসমূহে মাৰ্জ কৰা বৃদ্ধি কৰা 3D ছবি আৰু নিৰ্বাচিত Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰৰ এটা ঘূৰ্ণিত দৃশ্য দেখুৱায়।
Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰ আৰু এটা নিৰ্দিষ্ট ERES ৰ মাজৰ ঘনিষ্ঠ স্থানীয় সম্পৰ্কই ইংগিত দিয়ে যে Gas1-GFP এ নিৰ্বাচিত ERES ত প্ৰৱেশ কৰিব পাৰে, যিটো ER এৰি যাবলৈ Mid2-iRFP দ্বাৰা ব্যৱহাৰ কৰা নিৰ্বাচনশীলতাৰ পৰা পৃথক। এই সম্ভাৱনাক সমাধান কৰিবলৈ আমি মাত্ৰ এটা বা দুটা সামগ্ৰীৰ বাবে ERES অনুপাত পৰিমাণীকৰণ কৰিলোঁ (চিত্ৰ ২, A ৰ পৰা C)। আমি দেখিলোঁ যে বেছিভাগ ই আৰ ই এছ (৭০%)ত মাত্ৰ এটা ধৰণৰ মাল থাকে। চিত্ৰ 2C ৰ তলৰ ছবিখনে কেৱল Gas1-GFP (চিত্ৰ 1) বা কেৱল Mid2-iRFP (চিত্ৰ 2) ৰ সৈতে ERES ৰ দুটা সাধাৰণ উদাহৰণ দেখুৱাইছে। ইয়াৰ বিপৰীতে প্ৰায় ২০% ই আৰ ই এছত দুটা মাল থাকে যিবোৰ একে অঞ্চলতে ওপৰত ওপৰকৈ সোমাই থাকে। দেখা গ’ল যে কিছুমান ই আৰ ই এছ (১০%)ত দুবিধ সামগ্ৰী আছিল যদিও স্পষ্টভাৱে বেলেগ বেলেগ অঞ্চলত পৃথক কৰা হৈছিল। গতিকে এই পৰিসংখ্যা বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে ই আৰ ৰপ্তানি কৰাৰ পিছত জিপিআই-এপি গেছ১-জিএফপি আৰু ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন কাৰ্গো মিড২-আইআৰএফপিক বিভিন্ন ইআৰইএছত ভাগ কৰা হয় (চিত্ৰ ২ডি)। এই সজাই পৰাই তোলাৰ কাৰ্যক্ষমতা পূৰ্বৰ জৈৱৰাসায়নিক বিশ্লেষণ (৬) আৰু ৰূপতাত্ত্বিক নিৰ্ণয় (৭)ৰ সৈতে অতি সামঞ্জস্যপূৰ্ণ। আমি ই আৰ ই এছত প্ৰৱেশ কৰা কোৱাৰেণ্টাইন কৰা সামগ্ৰীৰ আচৰণো পৰ্যবেক্ষণ কৰিব পাৰো (চিত্ৰ ২ই আৰু চিনেমা এছ২)। চিত্ৰ 2E ত দেখুওৱা হৈছে যে Gas1-GFP (পেনেল 3) বা Mid2-iRFP (পেনেল 4) ৰ এটা সৰু অংশহে এটা ফালৰ পৰা ERES ত প্ৰৱেশ কৰে আৰু এটা বিচ্ছিন্ন অঞ্চলত আৱদ্ধ হৈ থাকে। চিত্ৰ ২E ৰ পেনেল ৫ ত দেখুওৱা হৈছে যে Gas1-GFP আৰু Mid2-iRFP কেতিয়াবা একেটা ERES ত পোৱা যায়, কিন্তু ইহঁত বিভিন্ন ফালৰ পৰা প্ৰৱেশ কৰে আৰু পৃথক অঞ্চলত কেন্দ্ৰীভূত হয় যিয়ে বিভিন্ন COPII ভেচিকলক প্ৰতিনিধিত্ব কৰিব পাৰে। আমি এইটোও নিশ্চিত কৰিলোঁ যে নিৰ্বাচিত ERES হিচাপে C26 ceramide-ভিত্তিক GPI-AP Gas1 ৰ পৰ্যবেক্ষণ পৃথকীকৰণ আৰু শ্ৰেণীবিভাজন নিৰ্দিষ্ট কাৰণ আন এটা ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৰণ কাৰ্গো, GFP-টেগ কৰা প্লাজমা মেমব্ৰেন প্ৰটিন Axl2 (27 ), Mid2-iRFP ৰ সৈতে একেধৰণৰ আচৰণ দেখুৱাই। (চিত্ৰ S1 আৰু চিনেমা S3)। নতুনকৈ সংশ্লেষিত Axl2-GFP Mid2-iRFP ৰ দৰে ER মেমব্ৰেনৰ মাজেৰে বিতৰণ কৰা হয় (চিত্ৰ S1, A আৰু B), আৰু বেছিভাগ ERES ত Mid2-iRFP ৰ সৈতে সহ-স্থানীয়কৃত হয় (চিত্ৰ S1, B ৰ পৰা D)। চিত্ৰ 1 ৰ পেনেল 1 আৰু 2. S1C এ ERES ৰ দুটা সাধাৰণ উদাহৰণ দেখুৱাইছে য'ত দুটা ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন কাৰ্গো ওভাৰলেপ হয়। এই ক্ষেত্ৰত দুয়োটা সামগ্ৰীয়ে একেলগে ERES ত প্ৰৱেশ কৰে (চিত্ৰ S1E, পেনেল 3 আৰু চলচ্চিত্ৰ S3)।
গেলেক্ট'জ প্ৰৰোচক নিঃসৰণ, Gas1-GFP (GPI-AP, সেউজীয়া) আৰু Mid2-iRFP (TMP, নীলা) আৰু গঠনমূলক ERES লেবেলিং Sec13-mCherry (ERES, magenta) প্ৰকাশ কৰা sec31-1 কোষক °C ত 30 মিনিট ইনকিউবেট কৰাৰ পিছত 37 ত ৰখা হৈছিল, নিঃসৰণ ব্লক মুক্ত কৰিবলৈ 24 °C লৈ লৈ যোৱা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত SCLIM ৰ সৈতে ছবি লোৱা হৈছিল ২০ মিনিট। (A to C) কাৰ্গো আৰু ERES দ্বাৰা চিহ্নিত 10 টা z-অংশৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক 2D প্ৰজেকচন ছবি (A; স্কেল বাৰ, 1μm) বা 3D কোষ গোলাৰ্ধৰ ছবি (B আৰু C; স্কেল ইউনিট, 0.456μm)। (B) ৰ তলৰ পেনেলে আৰু (C) ৰ পেনেলে কেৱল ERES (মেজেন্টা) [Gas1-GFP (ধূসৰ) আৰু Mid2-iRFP (পাতল নীলা)] ত উপস্থিত সামগ্ৰী প্ৰদৰ্শন কৰিবলৈ প্ৰচেছ কৰা ছবিসমূহ প্ৰদৰ্শন কৰে। (গ) মুকলি কাঁড় চিহ্ন: ই আৰ ই ইয়ে মাত্ৰ এটা সামগ্ৰীহে কঢ়িয়াই লৈ ফুৰে (১ৰ পৰা ৪)। ধূসৰ কাঁড় চিহ্ন: ERES ত পৃথক কৰা সামগ্ৰী (৫) থাকে। বগা কঠিন কাঁড় চিহ্ন: সহ-অৱস্থিত সামগ্ৰী যুক্ত ERES। তলত: নিৰ্বাচিত একক ERES ত কেৱল Gas1-GFP (1) বা Mid2-iRFP (2) থাকে। স্কেল বাৰ, ১০০ এন.এম. (ঘ) (C) ত বৰ্ণনা কৰা ফটোমাইক্ৰ’গ্ৰাফৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয়। মাত্ৰ এটা কাৰ্গো (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP), পৃথক কৰা কাৰ্গো আৰু ওভাৰলেপিং কাৰ্গো থকা ERES ৰ গড় শতাংশ। তিনিটা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাত ৫৪টা কোষত n=৪৩২। ত্ৰুটি বাৰ = SD। দুটা ঠেংযুক্ত অযোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা। *** পি = ০.০০০২। (ঙ) (C) ৰে চিহ্নিত কৰা কোৱাৰেণ্টাইন কৰা সামগ্ৰীৰ নিৰ্বাচিত ERES ৰ 3D ছবি। Gas1-GFP (সেউজীয়া) (3) বা Mid2-iRFP (নীলা) (4) এফালৰ পৰা ERES (magenta) ত প্ৰৱেশ কৰে আৰু ERES ৰ ভিতৰৰ এটা সৰু অঞ্চলত সীমাবদ্ধ থাকে। কেতিয়াবা, দুয়োবিধ সামগ্ৰী একেফালৰ পৰা একেটা ই আৰ ই এছ (৫)ত প্ৰৱেশ কৰি ই আৰ ই এছৰ ভিতৰৰ কোনো বিচ্ছিন্ন অঞ্চলত আৱদ্ধ হৈ থাকে। স্কেল বাৰ, ১০০ এন.এম.
ইয়াৰ পিছত আমি এটা ধাৰণা পৰীক্ষা কৰিলোঁ যে ই আৰ মেমব্ৰেনত উপস্থিত দীঘল এচিল চেইন চেৰামাইড (C26)-এ Gas1 ৰ নিৰ্দিষ্ট ক্লাষ্টাৰিং আৰু ছৰ্টিংক নিৰ্বাচিত ERES লৈ ড্ৰাইভ কৰে। এই উদ্দেশ্যে আমি এটা পৰিৱৰ্তিত ঈষ্ট ষ্ট্ৰেইন GhLag1 ব্যৱহাৰ কৰিছিলোঁ, য'ত দুটা এণ্ড'জেন চেৰামাইড চিনথেজ Lag1 আৰু Lac1ক GhLag1 (কপাহৰ Lag1 সমৰূপী) দ্বাৰা প্ৰতিস্থাপন কৰা হৈছিল, যাৰ ফলত বন্য প্ৰকাৰতকৈ চুটি কোষ পৰ্দা Ceramide ষ্ট্ৰেইন থকা এটা ঈষ্ট ষ্ট্ৰেইনৰ সৃষ্টি হৈছিল (চিত্ৰ 3A) (28)। গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান (MS) বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে বন্য প্ৰজাতিৰ ষ্ট্ৰেইনত মুঠ চেৰামাইডৰ ৯৫% অতি দীঘল (C26) শৃংখলাবদ্ধ চেৰামাইড, আনহাতে GhLag1 ত ৮৫% চেৰামাইড অতি দীঘল (C18 আৰু C16)। ), মাত্ৰ ২% চেৰামাইড অতি দীঘল (C26) শৃংখলাযুক্ত চেৰামাইড। যদিও এতিয়ালৈকে GhLag1 পৰ্দাত ধৰা পৰা মূল চেৰামাইড C18 আৰু C16 চেৰামাইড, এম এছ বিশ্লেষণে এইটোও নিশ্চিত কৰিছে যে GhLag1 ষ্ট্ৰেইনত প্ৰকাশ পোৱা Gas1-GFPৰ GPI এংকৰত C26 চেৰামাইড থাকে, যিটো বন্য প্ৰকাৰৰ লিপিডৰ সৈতে তুলনাযোগ্য। গুণগত মান একেই (চিত্ৰ ৩ক) (২৬)। গতিকে ইয়াৰ অৰ্থ হ’ল যে চেৰামাইড ৰিমডেলিং এনজাইম Cwh43 C26 চেৰামাইডৰ বাবে অতি নিৰ্বাচিত, চিত্ৰ ২৬ত দেখুওৱাৰ দৰে ই GhLag1 ষ্ট্ৰেইনত কম পৰিমাণৰ C26 চেৰামাইডৰ পৰা GPI এংকৰক অগ্ৰাধিকাৰভাৱে অন্তৰ্ভুক্ত কৰে। S2 (২৯)। তথাপিও GhLag1 ৰ কোষ পৰ্দাত মূলতঃ কেৱল C18-C16 চেৰামাইড থাকে, আনহাতে Gas1-GFP ত এতিয়াও C26 চেৰামাইড থাকে। এই তথ্যই এই ষ্ট্ৰেইনক ই আৰত মেমব্ৰেন চেৰামাইডৰ এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ সমস্যাটো বিশেষভাৱে সমাধান কৰিবলৈ এক আদৰ্শ আহিলা কৰি তোলে। শ্ৰেণী আৰু সজাই পৰাই তোলাৰ কাল্পনিক ভূমিকা। তাৰ পিছত, আমি প্ৰথমে গতানুগতিক প্ৰতিসৰণ মাইক্ৰস্কোপিৰ জৰিয়তে sec31-1 ৰ এটা উষ্ণতা-সংবেদনশীল মিউটেণ্ট এলিলৰ সৈতে GhLag1 ত থুপত জমা হোৱাৰ ক্ষমতা C26 Gas1-GFP অধ্যয়ন কৰিলোঁ, য'ত কেৱল দীঘলীয়া (C18-C16) শৃংখলটো ই আৰ মেমব্ৰেন চেৰামাইডত বিদ্যমান (চিত্ৰ 3)। আমি দেখিলোঁ যে sec31-1 ত Gas1-GFP ৰ অধিকাংশই ক্লাষ্টাৰত ঘনীভূত হৈছিল, আনহাতে দীঘল (C18-C16) দীঘল চেৰামাইড ই আৰ মেমব্ৰেনৰ সৈতে sec31-1 GhLag1 ত Gas1-GFP মূলতঃ সমগ্ৰ ই আৰ মেমব্ৰেনত ক্লাষ্টাৰ আৰু বিতৰণ কৰা হোৱা নাছিল। 1. আমি ইয়াৰ পিছত অনুসন্ধান কৰিলোঁ যে এই প্ৰক্ৰিয়াত ই আৰ ৰপ্তানি প্ৰটিন ব্যৱস্থাৰ কাৰ্য্যও জড়িত হ'ব পাৰে নেকি। GPI-AP এ ই আৰ ৰপ্তানিৰ বাবে এটা বিশেষ COPII ব্যৱস্থা ব্যৱহাৰ কৰে, যিটো GPI এংকৰৰ গ্লাইকেন অংশৰ Ted1 ৰ গাঁথনিগত পুনৰ নিৰ্মাণৰ দ্বাৰা সক্ৰিয়ভাৱে নিয়ন্ত্ৰিত হয় (30, 31)। তাৰ পিছত পুনঃসংযোজিত GPI-গ্লাইকেনক ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন কাৰ্গো ৰিচেপ্টৰ p24 কমপ্লেক্সে চিনাক্ত কৰে, যিয়ে পাছলৈ নিৰ্বাচিতভাৱে Lst1ক নিযুক্তি দিয়ে, যিটো প্ৰধান COPII কাৰ্গো বান্ধনি উপ-ইউনিট Sec24ৰ এটা নিৰ্দিষ্ট আইছ'ফৰ্ম, এটা GPI-AP-সমৃদ্ধ COPII ভেচিকল গঠন কৰে (31-33)। তেনেদৰে আমি এটা ডাবল মিউটেণ্ট নিৰ্মাণ কৰিলোঁ যিয়ে এই একক প্ৰটিনসমূহৰ ডিলিচন (p24 জটিল উপাদান Emp24, GPI-গ্লাইকেন ৰিমডেলিং এনজাইম Ted1 আৰু নিৰ্দিষ্ট COPII উপ-ইউনিট Lst1) sec31-1 মিউটেণ্ট ষ্ট্ৰেইনৰ সৈতে সংযুক্ত কৰি, আৰু সেইবোৰ অধ্যয়ন কৰিলোঁ Is it possible to form Gas1-cluster GFP (চিত্ৰ ৩)। আমি পৰ্যবেক্ষণ কৰিলোঁ যে sec31-1emp24Δ আৰু sec31-1ted1Δ ত Gas1-GFP মূলতঃ unclustered আৰু সমগ্ৰ ER মেমব্ৰেনত বিতৰণ কৰা হয়, পূৰ্বে sec31-1 GhLag1 ত দেখাৰ দৰে, আনহাতে sec31-1lst1Δ ত Gas1-GFP sec31-1 ৰ দৰে। এই ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে ই আৰ মেমব্ৰেনত C26 চেৰামাইডৰ উপস্থিতিৰ উপৰিও Gas1-GFP ৰ ক্লাষ্টাৰিং p24 কমপ্লেক্সৰ সৈতেও বান্ধ খাব লাগে, আৰু নিৰ্দিষ্ট Lst1 নিযুক্তিৰ প্ৰয়োজন নহয়। তাৰ পিছত আমি এই সম্ভাৱনা অন্বেষণ কৰিলোঁ যে ই আৰ মেমব্ৰেনত থকা চেৰামাইডৰ শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যই Gas1-GFP ৰ p24 ৰ সৈতে বান্ধোন নিয়ন্ত্ৰণ কৰিব পাৰে। কিন্তু আমি দেখিলোঁ যে মেমব্ৰেনত C18-C16 চেৰামাইডৰ উপস্থিতিয়ে p24 কমপ্লেক্সৰ দ্বাৰা পুনৰ্গঠন কৰা GPI-গ্লাইকেন (চিত্ৰ S3 আৰু S4, A আৰু B) বা GPI-AP ৰ সৈতে বান্ধ খাই GPI-AP ৰপ্তানি কৰা GPI-গ্লাইকেনসমূহক প্ৰভাৱিত নকৰে। সক্ষমতা। COPII উপপ্ৰকাৰ Lst1 নিযুক্তি দিয়ক (চিত্ৰ S4C)। গতিকে C26 চেৰামাইড-নিৰ্ভৰশীল ক্লাষ্টাৰিঙৰ বাবে বিভিন্ন ই আৰ ৰপ্তানি প্ৰটিন ব্যৱস্থাৰ সৈতে প্ৰটিনৰ পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়াৰ প্ৰয়োজন নহয়, কিন্তু লিপিডৰ দৈৰ্ঘ্যৰ দ্বাৰা পৰিচালিত বিকল্প সজাই পৰাই তোলা ব্যৱস্থাক সমৰ্থন কৰে। তাৰ পিছত আমি বিশ্লেষণ কৰিলোঁ যে ই আৰ মেমব্ৰেনত থকা চেৰামাইড এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্য Gas1-GFP ৰ নিৰ্বাচিত ERES হিচাপে ফলপ্ৰসূ শ্ৰেণীবিভাজনৰ বাবে গুৰুত্বপূৰ্ণ নেকি। যিহেতু চুটি শৃংখলাযুক্ত চেৰামাইডৰ সৈতে GhLag1 ষ্ট্ৰেইনৰ Gas1 ই আৰ এৰি প্লাজমা মেমব্ৰেনত প্ৰৱেশ কৰে (চিত্ৰ S5), আমি বিশ্বাস কৰোঁ যে যদি ছৰ্টিং চেৰামাইড এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ দ্বাৰা পৰিচালিত হয়, তেন্তে GhLag1 ষ্ট্ৰেইনৰ Gas1ক পুনৰ নিৰ্দেশিত কৰি ক্ৰছ কৰিব পাৰি। একেটা মেমব্ৰেনৰ সৈতে ERES সামগ্ৰী।
(A) GhLag1 ৰ কোষ পৰ্দাত মূলতঃ চুটি C18-C16 চেৰামাইড থাকে, আনহাতে Gas1-GFP ৰ GPI এংকৰত এতিয়াও বন্য প্ৰকাৰৰ কোষৰ দৰে একে C26 IPC থাকে। ওপৰত: গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান (MS) দ্বাৰা বন্য-প্ৰকাৰৰ (Wt) আৰু GhLag1p ষ্ট্ৰেইনৰ কোষ পৰ্দাত চেৰামাইডৰ এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্য বিশ্লেষণ। তথ্যই মুঠ চেৰামাইডৰ শতাংশক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। তিনিটা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ গড়। ত্ৰুটি বাৰ = SD। দুটা ঠেংযুক্ত অযোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা। **** পি <০.০০০১। তলৰ পেনেল: বন্য-প্ৰকাৰ আৰু GhLag1p ষ্ট্ৰেইনত প্ৰকাশ পোৱা Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI এংকৰত উপস্থিত IPC ৰ এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ MS বিশ্লেষণ। তথ্যই মুঠ আইপিচি সংকেতৰ শতাংশক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। পাঁচটা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাৰ গড়। ত্ৰুটি বাৰ = SD। দুটা ঠেংযুক্ত অযোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা। ns, গুৰুত্বপূৰ্ণ নহয়। পি = ০.৯১৩৪। (B) sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ আৰু sec31-1lst1Δ কোষৰ প্ৰতিসৰণ মাইক্ৰ'গ্ৰাফ গেলেক্ট'জ-প্ৰৰোচিত Gas1-GFP প্ৰকাশ কৰা কোষৰ 37°C ত 30 মিনিটৰ বাবে ইনকিউবেট কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত ৰুটিন প্ৰতিসৰণ মাইক্ৰস্কোপি সম্পন্ন কৰিবলৈ তললৈ প্ৰেৰণ কৰা হৈছিল ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ। বগা কাঁড় চিহ্ন: ই আৰ গেছ১-জিএফপি ক্লাষ্টাৰ। মুকলি কাঁড় চিহ্ন: আনক্লাষ্টাৰেড Gas1-GFP সমগ্ৰ ই আৰ মেমব্ৰেনত বিতৰণ কৰা হয়, ই আৰ বৈশিষ্ট্যপূৰ্ণ নিউক্লিয়াৰ ৰিং ষ্টেইনিং দেখুৱাই। স্কেল বাৰ, ৫μm। (C) (B) ত বৰ্ণনা কৰা ফটোমাইক্ৰ’গ্ৰাফৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয়। বিন্দুযুক্ত Gas1-GFP গঠন থকা কোষৰ গড় শতাংশ। তিনিটা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাত n≥300 কোষ। ত্ৰুটি বাৰ = SD। দুটা ঠেংযুক্ত অযোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা। **** পি <০.০০০১।
এই সমস্যাটো প্ৰত্যক্ষভাৱে সমাধান কৰিবলৈ আমি sec31-1 উষ্ণতা-সংবেদনশীল মিউটেণ্ট এলিলৰ সৈতে GhLag1 ত Gas1-GFP আৰু Mid2-iRFP ৰ SCLIM ভিজুৱেলাইজেচন সম্পন্ন কৰিলোঁ (চিত্ৰ 4 আৰু চলচ্চিত্ৰ S4)। ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ই আৰ ৰখাৰ পিছত আৰু তাৰ পিছত ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত মুক্ত কৰাৰ পিছত নতুনকৈ সংশ্লেষিত গেছ১-জিএফপিৰ বেছিভাগেই ক্লাষ্টাৰ হৈ সমগ্ৰ ই আৰ মেমব্ৰেনত বিতৰণ কৰা হোৱা নাছিল, যিটো প্ৰচলিত মাইক্ৰস্কোপৰ দ্বাৰা পৰ্যবেক্ষণ কৰা হৈছে (চিত্ৰ ৪, এ আৰু বি)। ইয়াৰ উপৰিও ই আৰ ই এছৰ বৃহৎ শতাংশ (৬৭%) ইয়াত সহ-অৱস্থিত দুবিধ সামগ্ৰী অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হয় (চিত্ৰ ৪D)। চিত্ৰ 4C ৰ পেনেল 1 আৰু 2 ত Gas1-GFP আৰু Mid2-GFP ৰ ওপৰত ওপৰত ওপৰ সোমাই থকা ERES ৰ দুটা সাধাৰণ উদাহৰণ দেখুওৱা হৈছে। ইয়াৰ উপৰিও দুয়োটা সামগ্ৰী একেটা ই আৰ ই এছত নিযুক্তি দিয়া হৈছিল (চিত্ৰ ৪ই, পেনেল ৩ আৰু চিনেমা এছ৪)। গতিকে আমাৰ ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে ই আৰ মেমব্ৰেনত থকা চেৰামাইড এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্য ই আৰ প্ৰটিনৰ সংগ্ৰহ আৰু শ্ৰেণীবিভাজনৰ এক গুৰুত্বপূৰ্ণ নিৰ্ণায়ক।
গেলেক্ট'জ-প্ৰৰোচিত নিঃসৰণ, Gas1-GFP (GPI-AP, সেউজীয়া) আৰু Mid2-iRFP (TMP, নীলা) আৰু গঠনমূলক ERES-লেবেলযুক্ত Sec13-mCherry (ERES, magenta) প্ৰকাশ কৰা Sec31-1 GhLag1 কোষ ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ইনকিউবেট কৰক। ৩০ মিনিট ধৰি ৰাখক, ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছলৈ নমাই নিঃসৰণ মুক্ত কৰক, আৰু ২০ মিনিটৰ পিছত SCLIM ৰ সহায়ত ছবিখন লওক। (A to C) কাৰ্গো আৰু ERES দ্বাৰা চিহ্নিত ১০টা z-অংশৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক 2D প্ৰজেকচন ছবি (A; স্কেল বাৰ, 1μm) বা 3D কোষ গোলাৰ্ধৰ ছবি (B আৰু C; স্কেল ইউনিট, 0.45μm)। (B) ৰ তলৰ পেনেলে আৰু (C) ৰ পেনেলে কেৱল ERES (মেজেন্টা) [Gas1-GFP (ধূসৰ) আৰু Mid2-iRFP (পাতল নীলা)] ত উপস্থিত সামগ্ৰী প্ৰদৰ্শন কৰিবলৈ প্ৰচেছ কৰা ছবিসমূহ প্ৰদৰ্শন কৰে। (গ) বগা ভৰ্তি কাঁড় চিহ্ন: ERES, সামগ্ৰী ওভাৰলেপ। খোলা কাঁড় চিহ্ন: ERES ত মাত্ৰ এটা বস্তু আছে। তলৰ পেনেল: নিৰ্বাচিত ERES ত (C) ত চিহ্নিত কৰা ওভাৰলেপিং সামগ্ৰী (1 আৰু 2) আছে। স্কেল বাৰ, ১০০ এন.এম. (ঘ) (C) ত বৰ্ণনা কৰা ফটোমাইক্ৰ’গ্ৰাফৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয়। sec31-1 আৰু sec31-1 GhLag1 ইউনিটত, মাত্ৰ এটা কাৰ্গো (Gas1-GFP বা Mid2-iRFP) অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হয়, আৰু পৃথক কাৰ্গো আৰু ওভাৰলেপিং কাৰ্গোৰ বাবে ERES ৰ গড় শতাংশ। তিনিটা স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাত ৫৪টা কোষত (sec31-1) n = 432 আৰু ৪৭টা কোষত (sec31-1 GhLag1) n = 430। ত্ৰুটি বাৰ = SD। দুটা ঠেংযুক্ত অযোৰযুক্ত টি পৰীক্ষা। *** P = 0.0002 (sec31-1) আৰু ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (E) (C) ত চিহ্নিত কৰা ওভাৰলেপিং কাৰ্গো (3) ৰ সৈতে নিৰ্বাচিত ERES ৰ 3D ছবি। Gas1-GFP (সেউজীয়া) আৰু Mid2-iRFP (নীলা) একে ফালৰ পৰা ERES (magenta) ৰ কাষ চাপে আৰু একে ERES নিষিদ্ধ অঞ্চলত থাকে। স্কেল বাৰ, ১০০ এন.এম.
এই অধ্যয়নে লিপিড ভিত্তিক প্ৰটিন কাৰ্গোসমূহক নিঃসৰণ পথত নিৰ্বাচিত ৰপ্তানি স্থানত শ্ৰেণীভুক্ত কৰা হয় বুলি প্ৰত্যক্ষ ইন ভিভ' প্ৰমাণ প্ৰদান কৰে, আৰু শ্ৰেণীবিভাজন নিৰ্বাচনশীলতাৰ বাবে এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ গুৰুত্ব উন্মোচন কৰে। SCLIM নামৰ এটা শক্তিশালী আৰু অত্যাধুনিক মাইক্ৰস্কোপি কৌশল ব্যৱহাৰ কৰি আমি নতুনকৈ সংশ্লেষিত Gas1-GFP (এটা প্ৰধান প্লাজমা মেমব্ৰেন GPI-AP ঈষ্টত এটা অতি দীঘল এচিল শৃংখল (C26) চেৰামাইড লিপিড অংশ) প্ৰদৰ্শন কৰিলোঁ (চিত্ৰ ১)। ইয়াৰ উপৰিও এই দুবিধ সামগ্ৰীয়ে নিৰ্বাচিতভাৱে বিভিন্ন ই আৰ ই এছত প্ৰৱেশ কৰে (চিত্ৰ ২)। মেমব্ৰেনত থকা কোষীয় চেৰামাইডৰ এচিল শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্য C26ৰ পৰা C18-C16 লৈ হ্ৰাস পায়, Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰটো বিচ্ছিন্ন ER অঞ্চললৈ বিঘ্নিত হয়, আৰু Gas1-GFP একেটা ERES ৰ জৰিয়তে ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন প্ৰটিনৰ সৈতে ER এৰি যাবলৈ পুনৰ পথ নিৰ্ধাৰণ কৰা হয় (চিত্ৰ 3 আৰু চিত্ৰ 3)। ৪)।
যদিও GPI-AP এ ER ৰ পৰা ওলাই আহিবলৈ এটা বিশেষ প্ৰটিন ব্যৱস্থা ব্যৱহাৰ কৰে, আমি দেখিলোঁ যে C26 চেৰামাইড-নিৰ্ভৰশীল পৃথকীকৰণ ERES বিশেষীকৰণৰ সূচনা কৰিব পৰা পাৰ্থক্যমূলক প্ৰটিন পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়াৰ ওপৰত নিৰ্ভৰশীল নহয় (চিত্ৰ S4 আৰু S5)। বৰঞ্চ আমাৰ তথ্যই লিপিড ভিত্তিক প্ৰটিন ক্লাষ্টাৰিং আৰু পৰৱৰ্তী সময়ত অন্যান্য সামগ্ৰীসমূহ বাদ দিয়াৰ দ্বাৰা পৰিচালিত বিকল্প শ্ৰেণীবিভাজন ব্যৱস্থাক সমৰ্থন কৰে। আমাৰ পৰ্যবেক্ষণে ইংগিত দিয়ে যে এটা নিৰ্দিষ্ট ERESৰ সৈতে জড়িত Gas1-GFP অঞ্চল বা ক্লাষ্টাৰত ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৃত প্ৰটিন Mid2-iRFPৰ অভাৱ, যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে C26 ceramide-নিৰ্ভৰশীল GPI-AP ক্লাষ্টাৰে প্ৰাসংগিক ERES ত তেওঁলোকৰ প্ৰৱেশ সহজ কৰি তুলিব, আৰু একে সময়তে, ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন বাদ দিব নিঃসৰণ এই বিশেষ ERESত প্ৰৱেশ কৰে (চিত্ৰ 1 আৰু 2)। ইয়াৰ বিপৰীতে ই আৰ মেমব্ৰেনত C18-C16 চেৰামাইডৰ উপস্থিতিয়ে জিপিআই-এপিয়ে অঞ্চল বা থুপ গঠন নকৰে, গতিকে ইহঁতে একেটা ই আৰ ই এছত ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন নিঃসৃত প্ৰটিনক বাদ নিদিয়ে বা সলনি নকৰে (চিত্ৰ ৩ আৰু ৪)। . গতিকে আমি প্ৰস্তাৱ দিছো যে C26 চেৰামাইডে নিৰ্দিষ্ট ERES ৰ সৈতে জড়িত প্ৰটিনৰ ক্লাষ্টাৰিংৰ সুবিধা কৰি পৃথকীকৰণ আৰু শ্ৰেণীবিভাজনক পৰিচালিত কৰে।
এই C26 চেৰামাইড-নিৰ্ভৰশীল ক্লাষ্টাৰিং কেনেকৈ এটা নিৰ্দিষ্ট ই আৰ এলেকাত লাভ কৰিব পাৰি? মেমব্ৰেন চেৰামাইডৰ পাৰ্শ্বীয়ভাৱে পৃথক হোৱাৰ প্ৰৱণতাই চুটি আৰু অসংপৃক্ত গ্লিচাৰলিপিড থকা ই আৰ মেমব্ৰেনৰ অধিক অনিয়মিত লিপিড পৰিৱেশত জিপিআই-এপি আৰু চি২৬ চেৰামাইড সৰু আৰু নিমিষতে ক্ৰমবদ্ধ লিপিড গঠন কৰিব পাৰে। গুণগত মানৰ ক্লাষ্টাৰ (১৭, ১৮)। এই সৰু অস্থায়ী থুপবোৰ p24 কমপ্লেক্সৰ সৈতে বান্ধ খাই থকাৰ পিছত আৰু অধিক ডাঙৰ, অধিক সুস্থিৰ থুপত সংযুক্ত কৰিব পাৰি (34)। ইয়াৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে আমি দেখুৱালোঁ যে C26 Gas1-GFP-এ বৃহৎ দৃশ্যমান থুপ গঠন কৰিবলৈ p24 কমপ্লেক্সৰ সৈতে পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া কৰিব লাগিব (চিত্ৰ ৩)। p24 কমপ্লেক্স হৈছে ঈষ্টত চাৰিটা ভিন্ন p24 ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন প্ৰটিনৰ দ্বাৰা গঠিত এটা হেটেৰ'জাইগাছ অলিগ'মাৰ (35), যিয়ে বহুসম্বন্ধীয় বান্ধনি প্ৰদান কৰে, যিয়ে সৰু GPI-AP ক্লাষ্টাৰৰ ক্ৰছ-লিংকিঙৰ সূচনা কৰিব পাৰে, যাৰ ফলত বৃহৎ Stable ক্লাষ্টাৰ (34) সৃষ্টি হয়। স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ মেৰুকৃত এপিথেলিয়াল কোষত ইহঁতৰ গলজি পৰিবহণৰ সময়ত দেখুওৱাৰ দৰে জিপিআই-এপিৰ প্ৰটিন এক্ট'ডমেইনৰ মাজৰ পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়াইও ইহঁতৰ একত্ৰীকৰণত অৰিহণা যোগাব পাৰে (৩৬)। কিন্তু যেতিয়া ই আৰ মেমব্ৰেনত C18-C16 চেৰামাইড থাকে, যেতিয়া p24 কমপ্লেক্সে Gas1-GFPৰ সৈতে বান্ধ খায়, তেতিয়া বৃহৎ পৃথক থুপ গঠন নহ’ব। ইয়াৰ অন্তৰ্নিহিত ব্যৱস্থাটো দীঘলীয়া এচিল শৃংখলযুক্ত চেৰামাইডৰ নিৰ্দিষ্ট ভৌতিক আৰু ৰাসায়নিক ধৰ্মৰ ওপৰত নিৰ্ভৰ কৰিব পাৰে। কৃত্ৰিম আৱৰণৰ জৈৱ-ভৌতিক অধ্যয়নে দেখুৱাইছে যে যদিও দীঘল (C24) আৰু চুটি (C18-C16) এচিল শৃংখলযুক্ত চেৰামাইড দুয়োটাই পৰ্যায় পৃথকীকৰণৰ সৃষ্টি কৰিব পাৰে, কেৱল দীঘল এচিল শৃংখলযুক্ত চেৰামাইড (C24)হে উচ্চ বক্ৰতা আৰু ফিল্ম বেণ্ডিংক প্ৰসাৰিত কৰি ফিল্মটোক পুনৰ আকৃতি দিব পাৰে। পাৰস্পৰিক উল্লেখৰ জৰিয়তে (১৭, ৩৭, ৩৮)। দেখা গৈছে যে Emp24 ৰ মানৱ সমৰূপী TMED2 ৰ ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন হেলিক্সে চাইট’প্লাজমিক লোবুলত C18 চেৰামাইড ভিত্তিক স্ফিংগোমাইলিনৰ সৈতে নিৰ্বাচিতভাৱে ক্ৰিয়া কৰে (39)। আণৱিক গতিবিদ্যা (MD) চিমুলেচন ব্যৱহাৰ কৰি আমি দেখিলোঁ যে C18 আৰু C26 দুয়োটা চেৰামাইড Emp24 ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন হেলিক্সৰ চাইট'প্লাজমিক লোবুলৰ চাৰিওফালে জমা হয়, আৰু ইহঁতৰ পছন্দ একে (চিত্ৰ S6)। মন কৰিবলগীয়া যে ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে Emp24 ৰ ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন হেলিক্সে মেমব্ৰেনত লিপিডৰ অসমতাপূৰ্ণ বিতৰণৰ সূচনা কৰিব পাৰে। স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ কোষৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি শেহতীয়াকৈ এই ফলাফল। একেধৰণৰ এমডি চিমুলেচনেও ইথাৰ লিপিডৰ উপস্থিতি দেখুৱাইছে (40)। গতিকে আমি অনুমান কৰিছোঁ যে ER26 ৰ দুটা লোবুলত থকা C26 চেৰামাইড স্থানীয়ভাৱে সমৃদ্ধ। যেতিয়া লুমিনেল লোবুলত থকা জিপিআই-এপিয়ে প্ৰত্যক্ষভাৱে বহুসম্বন্ধীয় p24ৰ সৈতে বান্ধ খায় আৰু চাইট’প্লাজমিক লোবুলত p24ৰ চাৰিওফালে C26 চেৰামাইডৰ সঞ্চয় হয়, তেতিয়া ই সংলগ্ন প্ৰটিনৰ একত্ৰীকৰণক প্ৰসাৰিত কৰিব পাৰে আৰু আঙুলিৰ জৰিয়তে মেমব্ৰেন বক্ৰতা সৃষ্টি হয় (41), যাৰ ফলত জিপিআই-এপি ইআৰএছৰ কাষৰ বিচ্ছিন্ন অঞ্চলত পৃথক হয়, যিয়ে অতি বক্ৰ অঞ্চলকো অনুকূল কৰে ই আৰ মেমব্ৰেনৰ অঞ্চলত (৪২)। পূৰ্বৰ প্ৰতিবেদনসমূহে প্ৰস্তাৱিত ব্যৱস্থাটোক সমৰ্থন কৰিছিল (৪৩, ৪৪)। প্লাজমা পৰ্দাত চেৰামাইড ভিত্তিক গ্লাইকোছফিংগোলিপিড (GSL)ৰ সৈতে অলিগ'লেক্টিন, ৰোগকাৰক বা এন্টিব'ডিৰ বহুসম্বন্ধীয় বান্ধনিয়ে বৃহৎ GSL সংগ্ৰহৰ সূচনা কৰে, পৰ্যায় পৃথকীকৰণ বৃদ্ধি কৰে আৰু পৰ্দাৰ বিকৃতি আৰু আভ্যন্তৰীণকৰণৰ সৃষ্টি কৰে (44)। ইৱাবুচি আদি (৪৩) দেখা গ’ল যে দীঘলীয়া (C24) কিন্তু চুটি নহয় (C16) এচিল শৃংখলৰ উপস্থিতিত জিএছএল লেক্ট’চাইলচেৰামাইডৰ সৈতে বান্ধ খাই থকা বহুসম্বন্ধীয় লিগাণ্ডে বৃহৎ থুপ আৰু মেমব্ৰেন ইনভেজিনেচন গঠন কৰে আৰু লিফলেটত চাইট’প্লাজম লিন-মধ্যস্থতাকাৰী সংকেত পৰিবহন সংযোজিত এচিল শৃংখলৰ দ্বাৰা আন্তঃডিজিটেট হয় নিউট্ৰফিল।
স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ মেৰুকৃত এপিথেলিয়াল কোষত এপিকেল প্লাজমা মেমব্ৰেনৰ স্তৰলৈকে এণ্টি-গলজি নেটৱৰ্ক (টিজিএন)ৰ ঘনত্বই জিপিআই-এপিৰ পৃথকীকৰণ আৰু সজাই পৰাই তোলা নিয়ন্ত্ৰণ কৰে (১০, ৪৫)। এই একত্ৰীকৰণ GPI-AP অলিগোমেৰাইজেচন (36) দ্বাৰা পৰিচালিত হয়, কিন্তু ই আমি ঈষ্টত পোৱা চেৰামাইড শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ ওপৰতো নিৰ্ভৰ কৰিব পাৰে। যদিও স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ জিপিআই-এপিৰ ইথাৰ লিপিড ভিত্তিক এংকৰ আছে, আৰু ইয়াৰ ৰাসায়নিক গঠন অতি দীঘল এচিল শৃংখলৰ চেৰামাইডৰ পৰা বহুত বেলেগ, শেহতীয়াকৈ কৰা এক অধ্যয়নত দেখা গৈছে যে দুয়োটা লিপিডৰ বিৱৰ্তনৰ ফালৰ পৰা একে ধৰণৰ ভৌতিক আৰু ৰাসায়নিক ধৰ্ম আৰু কাৰ্য্য আছে (৪০)। গতিকে স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ কোষত ইথাৰ লিপিডৰ অংশটো ঈষ্টত থকা C26 চেৰামাইডৰ সৈতে একে হ’ব পাৰে, আৰু ইয়াৰ ভূমিকা হ’ল জিপিআই-এপিৰ সংগ্ৰহ আৰু সজাই পৰাই তোলাৰ বাবে পৰ্দাত থকা দীঘল শৃংখলাযুক্ত চেৰামাইডৰ সৈতে জড়িত হোৱা। যদিও এই সম্ভাৱনা এতিয়াও প্ৰত্যক্ষভাৱে পৰীক্ষা কৰাৰ প্ৰয়োজন আছে, পূৰ্বৰ তথ্যসমূহে সমৰ্থন কৰে যে দীঘল এচিল শৃংখলাযুক্ত চেৰামাইডৰ গলজি বডিলৈ পৰিবহণ চাইট’প্লাজমিক ট্ৰেন্সফাৰ প্ৰ’টিনৰ দ্বাৰা নহয়, বৰঞ্চ ই ঈষ্টৰ দৰে জিপিআই এংকৰৰ সংশ্লেষণৰ ওপৰত নিৰ্ভৰশীল। গতিকে বিৱৰ্তনশীল ৰক্ষণশীল ব্যৱস্থাটোৱে একেটা পৰিবহণ ভেচিকলতে অতি দীঘল এচিল শৃংখলৰ চেৰামাইড আৰু জিপিআই-এপি (১৩, ১৬, ২০, ৪৬, ৪৭)ক নিৰ্বাচিতভাৱে সহ-পৰিবহন কৰিবলৈ সক্ষম হোৱা যেন লাগে।
ঈষ্ট আৰু স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ মেৰুকৃত এপিথেলিয়াল কোষ ব্যৱস্থাত জিপিআই-এপিৰ সংগ্ৰহ আৰু অন্যান্য প্লাজমা মেমব্ৰেন প্ৰটিনৰ পৰা পৃথক হোৱা এই সকলোবোৰ কোষৰ পৃষ্ঠত উপনীত হোৱাৰ আগতেই ঘটে। Paladino et al. স্তন্যপায়ী প্ৰাণীৰ মেৰুকৃত এপিথেলিয়াল কোষৰ টিজিএনত জিপিআই-এপি ক্লাষ্টাৰিং কেৱল এপিকেল প্লাজমা মেমব্ৰেনলৈ জিপিআই-এপিৰ নিৰ্বাচিত শ্ৰেণীবিভাজনৰ বাবেই প্ৰয়োজনীয় নহয়, জিপিআই-এপিৰ ক্লাষ্টাৰিং সংগঠন আৰু ইয়াৰ জৈৱিক কাৰ্য্যকলাপকো নিয়ন্ত্ৰণ কৰে। কোষৰ পৃষ্ঠভাগ। ঈষ্টত এই অধ্যয়নে দেখুৱাইছে যে ই আৰত থকা চি২৬ চেৰামাইড-নিৰ্ভৰশীল জিপিআই-এপি ক্লাষ্টাৰে প্লাজমা মেমব্ৰেনত জিপিআই-এপিৰ ক্লাষ্টাৰ সংগঠন আৰু কাৰ্য্যকৰী কাৰ্য্যকলাপ নিয়ন্ত্ৰণ কৰিব পাৰে (২৪, ৪৯)। এই মডেলৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণ, GhLag1 কোষ GPI প্ৰতিৰোধক বা কোষ বেৰৰ অখণ্ডতাক প্ৰভাৱিত কৰা ঔষধৰ এলাৰ্জী (28), আৰু ঈষ্ট কোষৰ সংগমত প্ৰক্ষেপিত টিপ চেৰামাইডৰ কাৰ্য্যকৰী Gas1-GFP ক্লাষ্টাৰ (49)ৰ প্ৰয়োজনীয়তাই G hLag1 কোষৰ সম্ভাৱ্য শাৰীৰিক পৰিণতিৰ ইংগিত দিয়ে। GPI-AP ত্ৰুটি। কিন্তু লিপিডৰ দৈৰ্ঘ্যৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি ছৰ্টিং পদ্ধতিৰে ই আৰৰ পৰা কোষৰ পৃষ্ঠৰ কাৰ্য্যকৰী সংগঠন প্ৰগ্ৰেম কৰা হৈছে নে নাই সেই বিষয়ে অধিক পৰীক্ষা কৰাটো আমাৰ ভৱিষ্যতৰ গৱেষণাৰ বিষয় হ’ব।
এই কামত ব্যৱহৃত Saccharomyces cerevisiae ষ্ট্ৰেইনসমূহ সূচী S1 ত তালিকাভুক্ত কৰা হৈছে। জীৱন্ত কোষৰ ইমেজিঙৰ বাবে SCLIM ৰ MMY1583 আৰু MMY1635 ষ্ট্ৰেইন W303 ৰ পটভূমিত নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। এই ষ্ট্ৰেইনসমূহে এটা ফ্লু'ৰেচেণ্ট প্ৰটিন টেগৰ সৈতে Sec13-mCherry প্ৰকাশ কৰা ষ্ট্ৰেইনসমূহক টেমপ্লেট হিচাপে pFA6a প্লাজমিডৰ সৈতে পলিমেৰেজ শৃংখলাবদ্ধ বিক্ৰিয়া (PCR)-ভিত্তিক পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰি নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল (23)। GAL1 প্ৰ’ম’টাৰৰ নিয়ন্ত্ৰণত ফ্লু’ৰেচেণ্ট প্ৰ’টিনেৰে লেবেল কৰা Mid2-iRFP প্ৰকাশ কৰা ষ্ট্ৰেইনটো তলত দিয়া ধৰণে নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। pKTiRFP-KAN ভেক্টৰৰ পৰা iRFP-KanMx ক্ৰমৰ PCR পৰিবৰ্ধন (ই. Mid2-iRFP জিনম ক্ৰমটোক পৰিবৰ্ধিত কৰি GAL1 প্ৰ'ম'টাৰত ক্ল'ন কৰাৰ পিছত ইয়াক সংহতি প্লাজমিড pRS306 ৰ Not I-Sac I স্থানত সংযুক্ত কৰা হয়। ফলত পোৱা প্লাজমিড pRGS7ক Pst I ৰ সৈতে ৰৈখিক কৰি URA3 লোকাছত একত্ৰিত কৰা হৈছিল।
Gas1-GFP সংযোজন জিনটো কেন্দ্ৰমিৰ (CEN) প্লাজমিডত GAL1 প্ৰ’ম’টাৰৰ নিয়ন্ত্ৰণত প্ৰকাশ পায়, যিটো তলত দিয়া ধৰণে নিৰ্মাণ কৰা হয়। Gas1-GFP ক্ৰমটো pRS416-GAS1-GFP প্লাজমিড (24) (L. Popolo ৰ উপহাৰ)ৰ পৰা PCR দ্বাৰা বৃদ্ধি কৰা হৈছিল আৰু CEN প্লাজমিড pBEVY-GL LEU2 (C ৰ উপহাৰ) ৰ Xma I–Xho I স্থানত ক্ল'ন কৰা হৈছিল। মিলাৰ; এডজিন প্লাজমিড নম্বৰ ৫১২২৫; http://n2t.net/addgene: ৫১২২৫; আৰ আৰ আই ডি: এডজিন_৫১২২৫)। ফলত পোৱা প্লাজমিডটোৰ নাম ৰখা হ’ল pRGS6। Axl2-GFP সংযোজন জিনটোও pBEVY-GL LEU2 ভেক্টৰৰ GAL1 প্ৰ’ম’টাৰৰ নিয়ন্ত্ৰণত প্ৰকাশ পায়, আৰু ইয়াৰ নিৰ্মাণ তলত দিয়া ধৰণৰ। PCR দ্বাৰা pRS304-p2HSE-Axl2-GFP প্লাজমিডৰ পৰা Axl2-GFP ক্ৰম বৃদ্ধি কৰা হৈছিল, আৰু pBEVY-GL LEU2 ভেক্টৰৰ Bam HI-Pst I স্থানত ক্ল'ন কৰা হৈছিল। ফলত পোৱা প্লাজমিডটোৰ নাম ৰখা হ’ল pRGS12। এই অধ্যয়নত ব্যৱহৃত অলিগ’নিউক্লিঅ’টাইডৰ ক্ৰম সূচী S2 ত তালিকাভুক্ত কৰা হৈছে।
ষ্ট্ৰেইনটোক ০.২% এডেনিন আৰু ২% গ্লুক’জ [YP-dextrose (YPD)], ২% ৰেফিন’জ [YP-raffinose] সমৃদ্ধ ঈষ্ট নিষ্কাশন প্ৰটিন p (YP) মাধ্যম (১ শতাংশ ঈষ্ট নিষ্কাশন আৰু ২% প্ৰটিন ept) দ্বাৰা পৰিপূৰক হিচাপে দিয়া হৈছিল। (YPR)] বা ২% গেলেক্ট'জ [YP-গেলেক্ট'জ (YPG)] কাৰ্বনৰ উৎস হিচাপে, বা কৃত্ৰিম নূন্যতম মাধ্যমত (০.১৫% ঈষ্ট নাইট্ৰজেন বেচ আৰু ০.৫% এমোনিয়াম ছালফেট) পুষ্টিৰ বাবে প্ৰয়োজনীয় উপযুক্ত এমিনো এচিড আৰু বেছৰ পৰিপূৰক হিচাপে , আৰু ২% গ্লুক'জ (কৃত্ৰিম গ্লুক'জ নূন্যতম মাধ্যম) বা ২% গেলেক্ট'জ যুক্ত (কৃত্ৰিম গেলেক্ট’জ নূন্যতম মাধ্যম) কাৰ্বনৰ উৎস হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
বাস্তৱ সময়ৰ ইমেজিঙৰ বাবে, GAL1 প্ৰ'ম'টাৰৰ অধীনত নিৰ্মাণ প্ৰকাশ কৰা উষ্ণতা-সংবেদনশীল sec31-1 মিউটেণ্ট কোষক YPR মাধ্যমত ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাতিটোৰ বাবে মিড-লগ পৰ্যায়লৈকে বৃদ্ধি কৰা হৈছিল। ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১ ঘণ্টা ধৰি ৱাইপিজিত প্ৰৰোচনা কৰাৰ পিছত কোষবোৰক ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত এছজিত ৩০ মিনিট ইনকিউবেট কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত ২৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছলৈ স্থানান্তৰিত কৰি নিঃসৰণ ব্লকৰ পৰা মুক্ত কৰা হয়। কনকানাভেলিন এ ব্যৱহাৰ কৰি কোষবোৰ কাঁচৰ স্লাইডত স্থাপন কৰা হৈছিল আৰু SCLIM দ্বাৰা ছবি তোলা হৈছিল। SCLIM হৈছে অলিম্পচ IX-71 ওলোটা ফ্লু'ৰেচেন্স মাইক্ৰস্কোপ আৰু UPlanSApo 100×1.4 সংখ্যাগত এপাৰচাৰ অইল লেন্স (Olympus), হাই-স্পীড আৰু হাই-চিগনেল-টু-নয়েজ ৰেচিঅ' ঘূৰ্ণনশীল ডিস্ক কনফ'কেল স্ক্যানাৰ (Yokogawa ইলেক্ট্ৰিক), কাষ্টম স্পেকট্ৰ'মিটাৰ, আৰু কাষ্টম কুলিঙৰ সংমিশ্ৰণ ফটোনিক্স)-এ ×২৬৬.৭ চূড়ান্ত বৃদ্ধিৰ সৈতে এটা মেগনিফাইং লেন্স ব্যৱস্থা আৰু ইলেক্ট্ৰনক গুণ কৰা চাৰ্জ-কাপল্ড ডিভাইচ কেমেৰা (হামামাটছু ফ'টনিক্স) (২১) প্ৰদান কৰিব পাৰে। ছবি আহৰণ কাষ্টম চফট্ ৱেৰ (Yokogawa Electric) দ্বাৰা কৰা হয়। 3D ছবিৰ বাবে আমি উদ্দেশ্য লেন্সক উলম্বভাৱে কম্পন কৰিবলৈ এটা কাষ্টম-মেইড পাইজোইলেক্ট্ৰিক এক্টিভেটৰ ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ, আৰু অপটিকেল অংশবোৰ 100 nm দূৰত্বত এটা ষ্টেকত সংগ্ৰহ কৰিলোঁ। Z-stack ছবিখনক 3D ভক্সেল ডাটালৈ ৰূপান্তৰ কৰা হয়, আৰু ঘূৰ্ণনশীল ডিস্ক কনফ'কেল মাইক্ৰস্কোপৰ বাবে ব্যৱহৃত তাত্ত্বিক বিন্দু বিস্তাৰ ফলনটো ভ'ল'চিটি চফট্ ৱেৰ (পাৰ্কিনএলমাৰ) দ্বাৰা ডিকনভল্যুচন প্ৰচেছিঙৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয়। সহ-অৱস্থান বিশ্লেষণৰ বাবে স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে থ্ৰেছহ’ল্ড কৰিবলৈ ভল’চিটি চফট্ ৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি কাৰ্গোকে ধৰি ই আৰ ই এছ জুখিছিল। লাইন স্কেন বিশ্লেষণ মেটামৰ্ফ চফট্ ৱেৰ (মলিকুলাৰ ডিভাইচ) ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হৈছিল।
পৰিসংখ্যাগত তাৎপৰ্য্য নিৰ্ণয় কৰিবলৈ GraphPad Prism চফ্টৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰক। দুটা ঠেংযুক্ত ষ্টুডেণ্টৰ টি-টেষ্ট আৰু সাধাৰণ একমুখী ভেৰিয়েন্স বিশ্লেষণ (ANOVA) পৰীক্ষাৰ বাবে গোটসমূহৰ মাজৰ পাৰ্থক্যই P <0.05 (*) ৰ ওপৰত যথেষ্ট প্ৰভাৱ পেলোৱা বুলি ধৰা হয়।
Gas1-GFP ৰ ফ্লু'ৰেচেন্স মাইক্ৰস্কোপিৰ বাবে, লগ ফেজ কোষবোৰক YPD ত ৰাতিটোৰ বাবে বৃদ্ধি কৰা হৈছিল আৰু কেন্দ্ৰচালিত কৰি সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল, ফছফেট বাফাৰযুক্ত চেলাইনেৰে দুবাৰকৈ ধুইছিল, আৰু বৰফত কমেও ১৫ মিনিটৰ বাবে ইনকিউবেট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা ধৰণে মাইক্ৰস্কোপৰ অধীনত আগবাঢ়িছিল পৰীক্ষা (২৪)। অধিগ্ৰহণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল লেইকা ডিএমআই৮ মাইক্ৰস্কোপ (এইচচিএক্স পিএল এপিঅ’ ১০০৩/১.৪০ অইল পিএইচ৩ চিএছ)। .
৬৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১০ মিনিটৰ বাবে এছডিএছ নমুনা বাফাৰেৰে নমুনাবোৰ বিকৃত কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত এছডিএছ-পলিএক্ৰিলামাইড জেল ইলেক্ট্ৰ’ফ’ৰেচিছ (PAGE) দ্বাৰা পৃথক কৰা হৈছিল। ইমিউন’ব্লটিং বিশ্লেষণৰ বাবে প্ৰতিটো লেনত ১০ μl নমুনা লোড কৰা হৈছিল। প্ৰাথমিক এন্টিব’ডি: শহাপহুৰ পলিক্ল’নেল এন্টি-Gas1 ১:৩০০০ পাতল কৰা, শহাপহুৰ পলিক্ল’নেল এন্টি-Emp24 ১:৫০০ পাতল কৰা, আৰু শহাপহুৰ পলিক্ল’নেল এণ্টি-GFP (এইচ ৰিজমেনৰ পৰা উপহাৰ) ১:৩০০০ পাতল কৰা ব্যৱহাৰ কৰা। মাউছৰ মনোক্ল’নেল এণ্টি-Pgk1 এন্টিব’ডি ১:৫০০০ পাতল কৰি ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল (জে. ডি লা ক্ৰুজৰ পৰা উপহাৰ)। গৌণ এন্টিব’ডি: হৰ্চেৰেডিচ পেৰাক্সিডেজ (HRP) কনজুগেটেড ছাগলীৰ এন্টি-ৰেবিট ইমিউন’গ্ল’বিউলিন জি (IgG) ১:৩০০০ পাতল কৰি ব্যৱহাৰ কৰা হয় (পিয়ৰ্চ)। এইচ আৰ পি-কনজুগেটেড ছাগলীৰ এন্টি-মাউছ আই জি জি ১:৩০০০ (পিয়ৰ্চ) পাতল কৰি ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ছুপাৰচিগনেল ৱেষ্ট পিকো ৰিএজেণ্ট (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ৰ কেমিলুমিনেচেন্স পদ্ধতিৰে ইমিউন ৰেচপন্স জ’ন পৰ্যবেক্ষণ কৰা হৈছিল।
(৩১)ত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি সমৃদ্ধ ই আৰ অংশটোৰ ওপৰত এটা প্ৰাকৃতিক ইমিউন’প্ৰেচিপিটেচন পৰীক্ষা কৰা হৈছিল। মুঠতে, ঈষ্ট কোষবোৰক TNE বাফাৰ [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM ফেনাইলমিথাইলছালফ’নাইল ফ্ল’ৰাইড আৰু প্ৰটিজ ইনহিবিটাৰ মিশ্ৰণ)ৰে 600 nm ( OD600) ত 100 অপটিকেল ঘনত্বত দুবাৰকৈ ধুব লাগে। ইয়াক কাঁচৰ গুটিৰে ভাঙি পেলোৱা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত কোষৰ ধ্বংসাৱশেষ আৰু কাঁচৰ গুটিবোৰ কেন্দ্ৰচালিত কৰি আঁতৰাই পেলোৱা হৈছিল। তাৰ পিছত চুপাৰনেটেণ্টক ১৭,০০০ গ্ৰামত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰা হ’ল। পেলেটটো টিএনইত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি ডিজিটেলিছ চেপনিন ১% চূড়ান্ত ঘনত্বলৈ যোগ কৰা হ’ল। ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ঘূৰণীয়াকৈ ১ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰা হ’ল, আৰু তাৰ পিছত অদ্ৰৱণীয় উপাদানসমূহ ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৩,০০০ গ্ৰামত ৬০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰি আঁতৰাই পেলোৱা হ’ল। Gas1-GFP ইমিউন'প্ৰেচিপিটেচনৰ বাবে প্ৰথমে নমুনাটো খালী এগাৰ'জ বিড (ChromoTek) ৰ সৈতে ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১ ঘণ্টা প্ৰি-ইনকিউবেট কৰক, আৰু তাৰ পিছত GFP-Trap_A (ChromoTek) ৰ সৈতে ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৩ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰক। ইমিউন’প্ৰেচিপিটেটেড বিডবোৰ ০.২% ডাইগ’ক্সিজেনিন যুক্ত টিএনইৰে পাঁচবাৰ ধুই এছডিএছ নমুনা বাফাৰেৰে এলুট কৰা হৈছিল, এছডিএছ-পিএজিইত পৃথক কৰা হৈছিল আৰু ইমিউন’ব্লটিঙৰ দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল।
(31) ত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, সমৃদ্ধ ই আৰ ভগ্নাংশৰ ওপৰত ক্ৰছ-লিংকিং নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল। চমুকৈ ক’বলৈ গ’লে, সমৃদ্ধ ই আৰ অংশটোক ০.৫ মিলিমিটাৰ ডাইথাইঅ’বিছ(ছাক্সিনিমিডাইল প্ৰপিঅ’নেট) (পিয়ৰ্চ, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ৰকফৰ্ড, আই এল, আমেৰিকা; ২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ, ২০ মিনিট)ৰ সৈতে ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। গ্লাইচিন (৫০ মিলিমিটাৰ চূড়ান্ত ঘনত্ব, ৫ মিনিট, ২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ) যোগ কৰি ক্ৰছলিংকিং বিক্ৰিয়াটো বন্ধ কৰা হৈছিল।
পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি (৫০), বন্য-প্ৰকাৰ আৰু GhLag1 ষ্ট্ৰেইনত চেৰামাইডৰ এম এছ বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। মুঠতে ৩০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৱাইপিডিত কোষবোৰক ঘাতীয় পৰ্যায়লৈ (৩ৰ পৰা ৪ অ’ডি৬০০ ইউনিট/মিলিলিটাৰ) বৃদ্ধি কৰা হৈছিল আৰু ২৫×১০৭টা কোষ সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল। ইহঁতৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়া ট্ৰাইক্ল’ৰ’এচিটিক এচিডৰ দ্বাৰা নিৰ্বাপিত হয়। নিষ্কাশন দ্রাৱক [ইথানল, পানী, ইথাৰ, পাইৰিডিন আৰু ৪.২ এন এমোনিয়াম হাইড্ৰ’ক্সাইড (১৫:১৫:৫:১:০.০১৮ v/v)] আৰু ১.২ এনএমঅ’ল আভ্যন্তৰীণ মানক চি১৭ চেৰামাইড (৮৬০৫১৭, আভাণ্টি মেৰু লিপিড) মানৰ ব্যৱহাৰ কৰক। নিষ্কাশনৰ মৃদু ক্ষাৰকীয় হাইড্ৰ’লাইছিছ কৰিবলৈ মনোমিথাইলামাইন ৰিএজেণ্ট [মিথানল, পানী, n-বিউটানল আৰু মিথাইলামাইন দ্ৰৱ (৪:৩:১:৫ v/v)] ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু তাৰ পিছত নিমখমুক্ত কৰিবলৈ পানীৰে পৰিপূৰ্ণ n-বিউটানল ব্যৱহাৰ কৰক। শেষত নিষ্কাশনটো ধনাত্মক ধৰণৰ দ্রাৱক [ক্ল’ৰ’ফৰ্ম/মিথানল/পানী (২:৭:১) + ৫ মিলিমিটাৰ এমোনিয়াম এচিটেট]ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি গণ বৰ্ণালীমাপকত ইনজেকচন কৰা হ’ল। স্ফিংগোলিপিড অণু চিনাক্তকৰণ আৰু পৰিমাণ নিৰ্ণয়ৰ বাবে বহু-বিক্ৰিয়া নিৰীক্ষণ (MRM) কৰা হৈছিল। টি এছ কিউ ভেণ্টেজ টাৰ্চিয়েৰী কোৱাড্ৰুপোল ​​গণ বৰ্ণালীমাপক (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) লিপিড বিশ্লেষণৰ বাবে ৰবটিক নেন’ফ্ল’ আয়ন উৎস নেন’মেট এইচ ডি (এডভিয়ান বায়’ছায়েন্সেছ, ইথাকা, এন ৱাই)ৰে সজ্জিত। প্ৰতিটো চেৰামাইড শ্ৰেণীৰ বাবে সংঘৰ্ষ শক্তি অনুকূল কৰা হয়। এম এছ ডাটা পজিটিভ মোডত পোৱা গৈছিল। প্ৰতিটো জৈৱিক প্ৰতিলিপিৰ বাবে লিপিড সংকেত হৈছে তিনিটা স্বতন্ত্ৰ জোখৰ মধ্যমা।
(31) ত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, Gas1-GFP প্ৰকাশ কৰা কোষবোৰ (800×107)ক প্ৰাকৃতিক ইমিউন’প্ৰেচিপিটেচনৰ বলি কৰা হৈছিল। বিশুদ্ধ Gas1-GFP SDS-PAGE দ্বাৰা পৃথক কৰি পলিভিনাইলডিন ফ্ল’ৰাইড (PVDF) মেমব্ৰেনলৈ স্থানান্তৰ কৰা হৈছিল। পিভিডিএফক এমাইড ক’লাৰে ৰং কৰি প্ৰ’টিনটো দৃশ্যমান কৰা হৈছিল। PVDF ৰ পৰা Gas1-GFP বেণ্ড কাটি মিথানলে ৫ বাৰ আৰু লিকুইড ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী-MS (LC-MS) গ্ৰেডৰ পানীৰে এবাৰ ধুই পেলোৱা হ’ল। 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), বাফাৰ আৰু 500μl সদ্য দ্ৰৱীভূত 1 M ছডিয়াম নাইট্ৰাইট মিশ্ৰণৰ সৈতে 37°C ত 3 ঘণ্টা ধৰি মেমব্ৰেন ষ্ট্ৰিপটো ইনকিউবেট কৰি, লিপিড অংশটো Gas1-GFP ৰ পৰা মুক্ত হয় আৰু গ্লুক'ছামাইন আৰু ইনোচিটলৰ মাজত ইন'চিন ফছফেট চেৰামাইডৰ লাইজ কৰা হয় (51)। ইয়াৰ পিছত মেমব্ৰেন ষ্ট্ৰিপটো এল চি-এম এছ গ্ৰেডৰ পানীৰে চাৰিবাৰ ধুই কোঠাৰ উষ্ণতাত শুকুৱাই -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত নাইট্ৰজেন বায়ুমণ্ডলত বিশ্লেষণ নোহোৱালৈকে সংৰক্ষণ কৰা হ’ল। নিয়ন্ত্ৰণ হিচাপে প্ৰতিটো পৰীক্ষাৰ বাবে পিভিডিএফ মেমব্ৰেনৰ এটা খালী নমুনা ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত Gas1-GFP ৰ পৰা আহৰণ কৰা লিপিড বৰ্ণনা কৰা ধৰণে MS দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল (50)। মুঠতে জিপিআই-লিপিড যুক্ত পিভিডিএফ ষ্ট্ৰিপসমূহক ৭৫μl ঋণাত্মক ছাঁচ দ্রাৱক [ক্ল’ৰ’ফৰ্ম/মিথানল (১:২) + ৫ মিলিমিটাৰ এমোনিয়াম এচিটেট]ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি ইলেক্ট্ৰ’স্প্ৰে আয়নীকৰণ (ইএছআই)-এমআৰএম/এমএছ স্ফিংগোলিপিড প্ৰজাতিৰ বিশ্লেষণ (টিএছকিউ ভেণ্টেজ) পাছ কৰা হৈছিল। এই ক্ষেত্ৰত এম এছ তথ্য ঋণাত্মক আয়ন মোডত পোৱা গৈছিল।
পূৰ্বে উল্লেখ কৰা অনুসৰি জিপিআই এংকৰৰ লিপিড অংশটো [3H]-ইনোচিটল-লেবেলযুক্ত জিপিআই-এপিৰ পৰা পৃথক কৰা হৈছিল (16)। লিপিডবোৰক দ্রাৱক ব্যৱস্থা (৫৫:৪৫:১০ ক্ল’ৰ’ফৰ্ম-মিথানল-০.২৫% কেচিএল) ব্যৱহাৰ কৰি পাতল স্তৰৰ ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফীৰ দ্বাৰা পৃথক কৰা হৈছিল আৰু এফএলএ-৭০০০ (ফুজিফিল্ম) ব্যৱহাৰ কৰি দৃশ্যমান কৰা হৈছিল।
Gas1-GFP (600×107) প্ৰকাশ কৰা কোষবোৰক TNE বাফাৰৰ সৈতে TNE বাফাৰেৰে দুবাৰকৈ ধুই কাঁচৰ গুটিৰে ভাঙি পেলোৱা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত কোষৰ ধ্বংসাৱশেষ আৰু কাঁচৰ গুটি আঁতৰাবলৈ কেন্দ্ৰচালিত কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত চুপাৰনেটেণ্টক ১৭,০০০ গ্ৰামত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১ ঘণ্টা কেন্দ্ৰচালিত কৰা হ’ল। পেলেটটো টিএনইত ধুই ০.২% ডিজিটেলিছ চেপনিন যুক্ত টিএনইত ১ ইউ পিআই-পিএলচি (ইনভিট্ৰজেন)ৰ সৈতে ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰা হ’ল। এনজাইম ট্ৰিটমেণ্টৰ পিছত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৭,০০০ গ্ৰামত ১ ঘণ্টা ধৰি কেন্দ্ৰচালিত কৰি মেমব্ৰেনটো আঁতৰাই পেলোৱা হ’ল। Gas1-GFP ইমিউন’প্ৰেচিপিটেট কৰিবলৈ চুপাৰনেটেণ্টক GFP-Trap_A (ChromoTek) ৰ সৈতে ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। SDS-PAGE দ্বাৰা পৃথক কৰা বিশুদ্ধ Gas1-GFP ক Coomassie উজ্জ্বল নীলা ৰঙেৰে ৰং কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত আয়'ড'এচিটামাইডৰ সৈতে এলকাইলেচন আৰু ডাইথাইঅ'থ্ৰেইটলৰ দ্বাৰা হ্ৰাস কৰাৰ পিছত ট্ৰিপচিনৰ সৈতে ইন-জেল পাচন কৰা হৈছিল। জিপিআই-গ্লাইকেনৰ সৈতে ট্ৰিপ্টিক পেপটাইড আৰু পেপটাইড নিষ্কাশন আৰু শুকুৱাই লোৱা। শুকান পেপটাইডটো ২০ μl পানীত দ্ৰৱীভূত কৰা হ’ল। এল চি ত এটা অংশ (৮μl) বেজী দিব লাগে। নিৰ্দিষ্ট গ্ৰেডিয়েণ্ট পৰিস্থিতিত পেপটাইড পৃথক কৰিবলৈ এটা অক্টাডেচিলচিলেন (ODS) কলাম (Develosil 300ODS-HG-5; ভিতৰৰ ব্যাস ১৫০ মিলিমিটাৰ×১.০ মিলিমিটাৰ; নোমুৰা কেমিকেল, আইচি প্ৰিফেকচাৰ, জাপান) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। চলন্ত পৰ্যায়টো হ’ল দ্রাৱক A (০.০৮% ফৰ্মিক এচিড) আৰু দ্রাৱক B (৮০% এচিট’নাইট্ৰাইলত ০.১৫% ফৰ্মিক এচিড)। এক্সেলা এইচ পি এল চি ব্যৱস্থা (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, বষ্টন, মেছাচুচেটছ) ব্যৱহাৰ কৰি ৫৫ মিনিটৰ ভিতৰত ৫০ μl মিনিট-১ প্ৰবাহৰ হাৰত ৫ মিনিটৰ বাবে দ্রাৱক A ৰে স্তম্ভটো এলুট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত দ্রাৱক B ৰ ঘনত্ব ৪০% লৈ বৃদ্ধি কৰা হৈছিল। , আমেৰিকা যুক্তৰাষ্ট্ৰ)। ইলুয়েটক ই এছ আই আয়ন উৎসত অবিৰতভাৱে প্ৰৱেশ কৰা হৈছিল আৰু জিপিআই-গ্লাইকেন থকা ট্ৰিপ্টিক পেপটাইড আৰু পেপটাইডসমূহ এলটিকিউ অৰ্বিট্ৰেপ এক্সএল (হাইব্ৰিড ৰৈখিক আয়ন ট্ৰেপ-অৰ্বিট্ৰেপ গণ বৰ্ণালীমাপক; থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। এম এছ চেটআপত কেপিলাৰী উৎসৰ ভল্টেজ ৪.৫ কেভি হিচাপে নিৰ্ধাৰণ কৰা হৈছিল, আৰু ট্ৰেন্সফাৰ কেপিলাৰীৰ উষ্ণতা ৩০০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰখা হৈছিল। কেপিলাৰী ভল্টেজ আৰু টিউব লেন্স ভল্টেজ ক্ৰমে ১৫ ভি আৰু ৫০ ভি হিচাপে নিৰ্ধাৰণ কৰা হৈছিল। এম এছ তথ্য ধনাত্মক আয়ন মোডত (৬০,০০০ ৰিজ'লিউচন; প্ৰতি মিলিয়নত ১০ অংশৰ ভৰৰ সঠিকতা) ৩০০/মিটাৰ/জেড ভৰ/চাৰ্জ অনুপাত (মিটাৰ/জেড) ৩০০০ৰ ভৰ পৰিসৰত পোৱা গৈছিল (চিআইডি)]।
এমডি চিমুলেচন GROMACS (52) চফট্ ৱেৰ আৰু MARTINI 2 বল ক্ষেত্ৰ (53-55) ব্যৱহাৰ কৰি সম্পন্ন কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত CHARMM GUI মেমব্ৰেন বিল্ডাৰ (56, 57) ব্যৱহাৰ কৰি ডাইঅ'লিঅ'ইলফছফেটিডাইলক'লিন (DOPC) আৰু Cer C18 বা DOPC আৰু Cer C26 যুক্ত এটা দ্বিস্তৰ নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। Cer C26 ৰ টপোলজি আৰু স্থানাংক স্ফিংগোচিন ঠেংৰ পৰা অতিৰিক্ত গুটি আঁতৰাই DXCE ৰ পৰা আহৰণ কৰা হয়। দ্বৈত স্তৰৰ ভাৰসাম্য ৰক্ষা কৰিবলে তলত বৰ্ণনা কৰা প্ৰক্ৰিয়া ব্যৱহাৰ কৰক আৰু ইয়াক চলাওক, তাৰ পিছত Emp24 ধাৰণ কৰা এটা ব্যৱস্থাপ্ৰণালী নিৰ্মাণ কৰিবলে ব্যৱস্থাপ্ৰণালীৰ শেষ স্থানাংক ব্যৱহাৰ কৰক । ভিজুৱেল এমডি (ভিএমডি) সঁজুলি আণৱিক গঠন (৫৮) ব্যৱহাৰ কৰি ঈষ্ট Emp24 (অৱশিষ্ট ১৭৩ৰ পৰা ১৯৩)ৰ ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন ডমেইনক α-হেলিক্স হিচাপে নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত ওপৰত ওপৰ সোমাই থকা লিপিডবোৰ আঁতৰোৱাৰ পিছত প্ৰটিনটোক মোটাকৈ দানা কৰি CHARMM GUI ব্যৱহাৰ কৰি দ্বিস্তৰত সুমুৱাই দিয়া হ’ল। চূড়ান্ত ব্যৱস্থাত ১২০২টা ডিঅ’পিচি আৰু ৩০২টা চেৰ চি২৬ বা ১১৯৭টা ডিঅ’পিচি আৰু ২৯৫টা চেৰ চি১৮ আৰু ইম্প২৪ থাকে। ব্যৱস্থাটোক ০.১৫০M ঘনত্বলৈ আয়নীকৰণ কৰক। দুটা দ্বিস্তৰীয় ৰচনাৰ বাবে চাৰিটা স্বতন্ত্ৰ প্ৰতিলিপি কৰা হৈছিল।
লিপিড দ্বিস্তৰক CHARMM GUI প্ৰক্ৰিয়া ব্যৱহাৰ কৰি ভাৰসাম্য ৰক্ষা কৰা হয়, য'ত ৪০৫,০০০ পদক্ষেপ নূন্যতম কৰা আৰু তাৰ পিছত ভাৰসাম্য ৰক্ষা কৰা হয়, য'ত অৱস্থানৰ বাধা ক্ৰমান্বয়ে হ্ৰাস কৰা হয় আৰু আঁতৰোৱা হয়, আৰু সময়ৰ পদক্ষেপ ০.০০৫ পিএছৰ পৰা ০.০২ পিএছলৈ বৃদ্ধি কৰা হয়। ভাৰসাম্য ৰক্ষাৰ পিছত ই 0.02 ps ৰ সময়ৰ পদক্ষেপৰ সৈতে 6 μs উৎপন্ন কৰে। Emp24 সন্নিবিষ্ট কৰাৰ পিছত, একে CHARMM GUI প্ৰক্ৰিয়া ব্যৱহাৰ কৰক চিস্টেমক নূন্যতম আৰু ভাৰসাম্য ৰক্ষা কৰিবলে, আৰু তাৰ পিছত উৎপাদনত 8 ছেকেণ্ডৰ বাবে চলাওক।
সকলো ব্যৱস্থাৰ বাবে ভাৰসাম্য প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত চাপ বেৰেণ্ডচেন বেৰ’ষ্টেট (59) দ্বাৰা নিয়ন্ত্ৰিত হয়, আৰু উৎপাদন প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত চাপ পেৰিনেলো-ৰহমান বেৰ’ষ্টেট (60) দ্বাৰা নিয়ন্ত্ৰিত হয়। সকলো ক্ষেত্ৰতে গড় চাপ ১ বাৰ আৰু অৰ্ধ-সমসিদ্ধ চাপ সংযোজন আঁচনি ব্যৱহাৰ কৰা হয়। ভাৰসাম্য আৰু উৎপাদন প্ৰক্ৰিয়াত গতি পুনৰ মানাংকন কৰা থাৰ্মোষ্টেট (61) ব্যৱহাৰ কৰি ক্ৰমে প্ৰটিন, লিপিড আৰু দ্রাৱক কণিকাৰ উষ্ণতা সংযুক্ত কৰা হয়। সমগ্ৰ অপাৰেচনৰ সময়ছোৱাত লক্ষ্য উষ্ণতা ৩১০K। 0.005 বাফাৰ সহনশীলতাৰ সৈতে ভাৰলেট আঁচনি ব্যৱহাৰ কৰি এটা যোৰা তালিকা সৃষ্টি কৰি নন-বণ্ডিং পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া গণনা কৰা হয়। বিক্ৰিয়াৰ ক্ষেত্ৰ আৰু ১.১ এন এম কাট অফ দূৰত্ব ব্যৱহাৰ কৰি ক’লম্ব পদ গণনা কৰা হয়। ভেণ্ডাৰ ৱালছ শব্দটোৱে ১.১ এন এম কাট-অফ দূৰত্বৰ কাট-অফ আঁচনি ব্যৱহাৰ কৰে আৰু সম্ভাৱ্য ড্ৰিফ্টৰ বাবে ভাৰলেট কাট-অফ আঁচনি ব্যৱহাৰ কৰা হয় (৬২)।
ভিএমডি ব্যৱহাৰ কৰি ডিঅ’পিচি ফছফেট বিড বা চেৰামাইড এএম১ বিড আৰু প্ৰটিনৰ মাজৰ কাটঅফ তৰংগদৈৰ্ঘ্য ০.৭ এনএম, আৰু প্ৰটিনৰ সৈতে ক্ৰিয়া কৰা লিপিডৰ সংখ্যা গণনা কৰা হয়। তলৰ সূত্ৰ অনুসৰি (৬৩) ৰ দৰে ডিপ্লিচন-এনৰিচমেণ্ট (DE) কাৰক গণনা কৰা: DE কাৰক = (প্ৰটিনত থকা মুঠ লিপিডৰ পৰিমাণ ০.৭) প্ৰটিনত ০.৭ (মুঠ লিপিডত Cer ৰ পৰিমাণ)
ৰিপৰ্ট কৰা মান গড় হিচাপে পোৱা যায়, আৰু ভুল বাৰসমূহ SE ৰ চাৰিটা স্বতন্ত্ৰ কপি। DE কাৰকৰ পৰিসংখ্যাগত তাৎপৰ্য্য t পৰীক্ষাৰ দ্বাৰা গণনা কৰা হয় [(গড়DE-কাৰক-1)/SE]। এক-ঠেংযুক্ত বিতৰণৰ পৰা P মান গণনা কৰা।
ট্ৰেচৰ শেষৰ ২৫০ ns ৰ ভিতৰত Emp24 যুক্ত ব্যৱস্থাটোৰ ২D পাৰ্শ্বীয় ঘনত্বৰ মানচিত্ৰ গণনা কৰিবলৈ GROMACS সঁজুলি ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। চেৰামাইডৰ সমৃদ্ধি/ক্ষয়ৰ মানচিত্ৰ লাভ কৰিবলৈ Cer ৰ ঘনত্বৰ মানচিত্ৰক Cer আৰু DOPC ৰ মানচিত্ৰৰ যোগফলৰে ভাগ কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত শৰীৰত Cer ৰ ঘনত্বৰে ভাগ কৰা হয়। একেটা ৰঙৰ মেপ স্কেল ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
এই প্ৰবন্ধটোৰ বাবে পৰিপূৰক সামগ্ৰীৰ বাবে, অনুগ্ৰহ কৰি http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 চাওক
এইটো ক্ৰিয়েটিভ কমন্স এট্ৰিবিউচন-নন-কমাৰ্চিয়েল লাইচেন্সৰ চৰ্ত অনুসৰি বিতৰণ কৰা এটা মুক্ত প্ৰৱেশৰ প্ৰবন্ধ, যিয়ে যিকোনো মাধ্যমত ব্যৱহাৰ, বিতৰণ আৰু প্ৰজনন কৰাৰ অনুমতি দিয়ে, যেতিয়ালৈকে চূড়ান্ত ব্যৱহাৰ বাণিজ্যিক লাভৰ বাবে নহয় আৰু ভিত্তিটো হ'ল যে মূল কামটো শুদ্ধ। সন্দৰ্ভ।
টোকা: আমি আপোনাক কেৱল আপোনাৰ ইমেইল ঠিকনা দিবলৈ কওঁ যাতে আপুনি পৃষ্ঠালৈ পৰামৰ্শ দিয়া ব্যক্তিজনে জানে যে আপুনি তেওঁলোকে ইমেইলটো চাব বিচাৰে আৰু ই স্পেম নহয়। আমি কোনো ইমেইল ঠিকনা ধৰিব নোৱাৰো।
এই প্ৰশ্নটো আপুনি দৰ্শক নেকি পৰীক্ষা কৰিবলৈ আৰু স্বয়ংক্ৰিয় স্পেম জমা দিয়া ৰোধ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
ছফিয়া ৰড্ৰিগেজ-গালাৰ্ডো, কাজুও কুৰোকাৱা, চুছানা ছাবিডো-বোজো, আলেজান্দ্ৰ' কৰ্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্ৰ' কৰ্টেছ-গোমেজ), আটছুকো ইকেডা (আটছুকো ইকেডা), ভেলেৰিয়া জোনি (ভেলেৰিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোৰা এগুইলেৰা-ৰোমেৰো, আনা মাৰিয়া পেৰেজ -লিনেৰো), চাৰ্জিঅ' লোপেজ (চাৰ্জিও লোপেজ), মিহো ৱাগা (মিহো ৱাগা), মিছাকো আৰ্মান (মিছাকো আৰ্মান), মিয়াকো ৰিমান (মিয়াকো ৰিমান), প্ৰ’ আকিৰা, ষ্টেফানো ফেনি, আকিহিকো নাকানো, মেনুৱেল মুনিজ
3D হাই-ৰিজ'লিউচন ৰিয়েল-টাইম ইমেজিঙে নিৰ্বাচিত আউটপুট ছাইটত প্ৰটিন সজাই পৰাই তোলাৰ বাবে চেৰামাইড শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ গুৰুত্ব উন্মোচন কৰে।
ছফিয়া ৰড্ৰিগেজ-গালাৰ্ডো, কাজুও কুৰোকাৱা, চুছানা ছাবিডো-বোজো, আলেজান্দ্ৰ' কৰ্টেজ · গোমেজ (আলেজান্দ্ৰ' কৰ্টেছ-গোমেজ), আটছুকো ইকেডা (আটছুকো ইকেডা), ভেলেৰিয়া জোনি (ভেলেৰিয়া জোনি), অক্সিলিয়াডোৰা এগুইলেৰা-ৰোমেৰো, আনা মাৰিয়া পেৰেজ -লিনেৰো), চাৰ্জিঅ' লোপেজ (চাৰ্জিও লোপেজ), মিহো ৱাগা (মিহো ৱাগা), মিছাকো আৰ্মান (মিছাকো আৰ্মান), মিয়াকো ৰিমান (মিয়াকো ৰিমান), প্ৰ’ আকিৰা, ষ্টেফানো ফেনি, আকিহিকো নাকানো, মেনুৱেল মুনিজ
3D হাই-ৰিজ'লিউচন ৰিয়েল-টাইম ইমেজিঙে নিৰ্বাচিত আউটপুট ছাইটত প্ৰটিন সজাই পৰাই তোলাৰ বাবে চেৰামাইড শৃংখলৰ দৈৰ্ঘ্যৰ গুৰুত্ব উন্মোচন কৰে।
©২০২০ আমেৰিকান এছ'চিয়েচন ফৰ দ্য এডভান্সমেণ্ট অৱ চাইন্স। সকলো অধিকাৰ সংৰক্ষিত। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef আৰু COUNTER ৰ অংশীদাৰ। চাইন্সএডভান্সছ আই এছ এছ এন ২৩৭৫-২৫৪৮।