বৰ্তমান *বৰ্তমানৰ ঠিকনা: কলন ৫০৯৩১, জাৰ্মানী, কলন এক্সেলেন্স ক্লাষ্টাৰ ৰিচাৰ্চ অন চেলুলাৰ ষ্ট্ৰেছ ৰেচপন্স ইন এজিং-ৰিলেটেড ডিজিজ (CECAD)।
মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল ৰোগৰ স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ক অপ্ৰত্যাৱৰ্তনীয় বুলি গণ্য কৰা হয় কাৰণ নিউৰনৰ বিপাকীয় প্লাষ্টিচিটি সীমিত, কিন্তু শৰীৰৰ স্নায়ুকোষীয় বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ কোষৰ স্বায়ত্তশাসনৰ ওপৰত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ প্ৰভাৱৰ বিষয়ে ভালদৰে বুজা হোৱা নাই। ইয়াত আমি বিঘ্নিত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল সংযোজন গতিশীলতাৰ ফলত হোৱা প্ৰগতিশীল OXPHOS অভাৱৰ সৈতে Purkinje নিউৰনৰ কোষ-নিৰ্দিষ্ট প্ৰটিঅ’মৰ পৰিচয় দিওঁ। আমি দেখিলোঁ যে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ ফলত প্ৰটিঅ’মিক্সৰ ক্ষেত্ৰত গভীৰ পৰিৱৰ্তন ঘটিছিল, যিয়ে শেষত কোষৰ মৃত্যুৰ পূৰ্বে নিখুঁত বিপাকীয় কাৰ্যসূচীসমূহ ক্ৰমিকভাৱে সক্ৰিয় কৰি তুলিছিল। অপ্ৰত্যাশিতভাৱে আমি পাইৰুভেট কাৰ্বক্সিলেজ (PCx) আৰু অন্যান্য এন্টি-এজিং এনজাইমৰ স্পষ্ট প্ৰৰোচনা নিৰ্ণয় কৰিলোঁ যিয়ে টিচিএ চক্ৰৰ মধ্যৱৰ্তী পদাৰ্থসমূহৰ পৰিপূৰক। পিচিএক্সৰ প্ৰতিৰোধে অক্সিডেটিভ চাপ আৰু স্নায়ুৰ অৱক্ষয় বৃদ্ধি কৰিছিল, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে অক্সফ’এছৰ অভাৱত নিউৰনত এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছৰ সুৰক্ষামূলক প্ৰভাৱ পৰে। টাৰ্মিনেলভাৱে অৱক্ষয় হোৱা নিউৰনত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল সংযোজনৰ পুনৰুদ্ধাৰে এই বিপাকীয় বৈশিষ্ট্যসমূহ সম্পূৰ্ণৰূপে ওলোটা কৰি পেলায়, যাৰ ফলত কোষৰ মৃত্যু ৰোধ হয়। আমাৰ তথ্যই পূৰ্বতে অজ্ঞাত পথ চিনাক্ত কৰে যিয়ে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ প্ৰতি স্থিতিস্থাপকতা প্ৰদান কৰে আৰু দেখুৱাইছে যে ৰোগৰ শেষৰ পৰ্যায়তো স্নায়ুৰ অৱক্ষয় ওলোটা হ’ব পাৰে।
স্নায়ুকোষীয় শক্তি বিপাকীয় ক্ৰিয়া বজাই ৰখাত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কেন্দ্ৰীয় ভূমিকাক মানৱ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ৰোগৰ সৈতে জড়িত বিস্তৃত স্নায়ুজনিত লক্ষণসমূহে গুৰুত্ব আৰোপ কৰে। এই ৰোগসমূহৰ অধিকাংশই মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ জিন প্ৰকাশ (1, 2) নিয়ন্ত্ৰণ কৰা জিন মিউটেচন বা মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ গতিশীলতাৰ সৈতে জড়িত জিন ধ্বংসৰ ফলত হয়, যিয়ে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ডি এন এ (mtDNA)ৰ স্থিৰতাত পৰোক্ষভাৱে প্ৰভাৱ পেলায় (3, 4)। প্ৰাণীৰ আৰ্হিত কৰা কামে দেখুৱাইছে যে চাৰিওফালৰ কলাত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ প্ৰতিক্ৰিয়াত ৰক্ষণশীল বিপাকীয় পথ (৫-৭) সক্ৰিয় কৰিব পাৰি, যিয়ে এই জটিল ৰোগসমূহৰ ৰোগজন্মৰ গভীৰ বুজাবুজিৰ বাবে গুৰুত্বপূৰ্ণ তথ্য প্ৰদান কৰে। ইয়াৰ সম্পূৰ্ণ বিপৰীতে মগজুৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল এডিন’চিন ট্ৰাইফছফেট (ATP) উৎপাদনৰ সাধাৰণ ব্যৰ্থতাৰ ফলত হোৱা নিৰ্দিষ্ট কোষ প্ৰকাৰৰ বিপাকীয় পৰিৱৰ্তনৰ বিষয়ে আমাৰ বুজাবুজি মৌলিক (8), ৰোগ প্ৰতিৰোধ বা প্ৰতিৰোধৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰিব পৰা চিকিৎসা লক্ষ্য চিনাক্ত কৰাৰ প্ৰয়োজনীয়তাৰ ওপৰত গুৰুত্ব আৰোপ কৰা হৈছে। স্নায়ুৰ অৱক্ষয় ৰোধ কৰা (৯)। তথ্যৰ অভাৱ হ’ল যে চাৰিওফালৰ কলাৰ কোষ প্ৰকাৰৰ তুলনাত স্নায়ুকোষৰ বিপাকীয় নমনীয়তা অতি সীমিত বুলি বহুলভাৱে গণ্য কৰা হয় (১০)। এই কোষবোৰে চিনেপ্টিক সংক্ৰমণক প্ৰসাৰিত কৰিবলৈ আৰু আঘাত আৰু ৰোগৰ অৱস্থাৰ প্ৰতি সঁহাৰি জনাবলৈ নিউৰনলৈ বিপাকীয় পদাৰ্থৰ যোগানৰ সমন্বয়ত কেন্দ্ৰীয় ভূমিকা পালন কৰে বুলি ধৰি ল’লে, মগজুৰ কলাৰ প্ৰত্যাহ্বানমূলক অৱস্থাৰ সৈতে কোষৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়াক খাপ খুৱাই লোৱাৰ ক্ষমতা প্ৰায় গ্লিয়াল কোষত সীমাবদ্ধ হৈ থাকে (১১-১৪)। ইয়াৰ উপৰিও মগজুৰ কলাৰ অন্তৰ্নিহিত কোষীয় বৈষম্যই নিৰ্দিষ্ট স্নায়ুকোষীয় উপগোটত ঘটা বিপাকীয় পৰিৱৰ্তনৰ অধ্যয়নত বহুলাংশে বাধাৰ সৃষ্টি কৰে। ফলত নিউৰনত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ সঠিক কোষীয় আৰু বিপাকীয় পৰিণতিৰ বিষয়ে বহুত কমেইহে জনা যায়।
মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ বিপাকীয় পৰিণতি বুজিবলৈ আমি মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বাহিৰৰ পৰ্দাৰ সংযোজন (Mfn2) ধ্বংসৰ ফলত হোৱা স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ৰ বিভিন্ন পৰ্যায়ত থকা পাৰ্কিঞ্জে নিউৰন (PNs) পৃথক কৰিলোঁ। যদিও মানুহৰ Mfn2 মিউটেচন Charcot-Marie-Tooth টাইপ 2A (15) নামেৰে জনাজাত বংশগত মটৰ সংবেদনশীল নিউৰ'পেথীৰ এটা প্ৰকাৰৰ সৈতে জড়িত, এন্দুৰত Mfn2 চৰ্তসাপেক্ষ ধ্বংস অক্সিডেচন ফচফৰাইলেচন (OXPHOS) অকাৰ্য্যকৰী পদ্ধতিৰ এটা সুপৰিচিত প্ৰৰোচনা। বিভিন্ন স্নায়ুকোষীয় উপপ্ৰকাৰ (১৬-১৯) আৰু তাৰ ফলত হোৱা স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ী ফেন’টাইপৰ লগত প্ৰগতিশীল স্নায়ুজনিত লক্ষণ, যেনে গতিবিধিৰ বিকাৰ (১৮, ১৯) বা চেৰিবেলাৰ এটেক্সিয়া (১৬) দেখা যায়। লেবেল-মুক্ত পৰিমাণগত (LFQ) প্ৰটিঅ'মিক্স, মেটাব'ল'মিক্স, ইমেজিং, আৰু ভাইৰ'লজিকেল পদ্ধতিৰ সংমিশ্ৰণ ব্যৱহাৰ কৰি আমি দেখুৱাইছো যে প্ৰগতিশীল স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ে পাইৰুভেট কাৰ্বক্সিলেজ (PCx) আৰু অন্যান্য কাৰকসমূহক শক্তিশালীভাৱে প্ৰৰোচিত কৰে ইন ভিভ'ত এনজাইমৰ প্ৰকাশ। এই তথ্যৰ প্ৰাসংগিকতা পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি বিশেষভাৱে Mfn2-অভাৱী PNs ত PCx ৰ প্ৰকাশ ডাউন-ৰেগুলেট কৰিলোঁ, আৰু এই অপাৰেচনে অক্সিডেটিভ চাপ আৰু স্নায়ুৰ অৱক্ষয় ত্বৰান্বিত কৰি তুলিলে, যাৰ ফলত এজ'স্পাৰ্মিয়াই কোষৰ মৃত্যু বিপাকীয় অভিযোজন ক্ষমতা প্ৰদান কৰে বুলি প্ৰমাণ কৰিলোঁ। MFN2 ৰ গুৰুতৰ প্ৰকাশে গুৰুতৰ OXPHOS অভাৱ, মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ডি এন এৰ ব্যাপক ব্যৱহাৰ, আৰু আপাত দৃষ্টিত ভঙা মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল নেটৱৰ্কৰ সৈতে টাৰ্মিনেল ডিজেনেৰেচন পি এন সম্পূৰ্ণৰূপে উদ্ধাৰ কৰিব পাৰে, যিয়ে আৰু অধিক জোৰ দিয়ে যে এই ধৰণৰ স্নায়ুৰ অৱক্ষয় আনকি কোষৰ মৃত্যুৰ পূৰ্বে ৰোগৰ উন্নত পৰ্যায়তো আৰোগ্য লাভ কৰিব পাৰে।
Mfn2 নকআউট পিএনত মাইট'কণ্ড্ৰিয়াক কল্পনা কৰিবলৈ আমি এটা মাউছ ষ্ট্ৰেইন ব্যৱহাৰ কৰিলোঁ যিয়ে Cre-নিৰ্ভৰশীল মাইট'কণ্ড্ৰিয়াক হালধীয়া ফ্লু'ৰেচেণ্ট প্ৰ'টিন (YFP) (mtYFP) (20) Cre এক্সপ্ৰেচনক লক্ষ্য কৰি ল'বলৈ অনুমতি দিয়ে আৰু ভিভ'ত মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ আকৃতি পৰীক্ষা কৰিলোঁ। আমি দেখিলোঁ যে পিএনসমূহত Mfn2 জিন ধ্বংস হ’লে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল নেটৱৰ্ক ক্ৰমান্বয়ে বিভাজন হ’ব (চিত্ৰ S1A), আৰু আটাইতকৈ আগতীয়া পৰিৱৰ্তন ৩ সপ্তাহ বয়সত পোৱা গৈছিল। ইয়াৰ বিপৰীতে পি এন কোষ স্তৰৰ যথেষ্ট অৱক্ষয়, যিটো কেলবিণ্ডিন ইমিউন’ষ্টেইনিং হেৰুৱাৰ দ্বাৰা প্ৰমাণিত, ১২ সপ্তাহ বয়সলৈকে আৰম্ভ হোৱা নাছিল (চিত্ৰ ১, ক আৰু খ)। মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ আকৃতিৰ প্ৰাৰম্ভিক পৰিৱৰ্তন আৰু স্নায়ুকোষৰ মৃত্যুৰ দৃশ্যমান আৰম্ভণিৰ মাজৰ সময়ৰ মিল নোহোৱাটোৱে আমাক কোষৰ মৃত্যুৰ পূৰ্বে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ অকাৰ্য্যকৰীতাৰ ফলত হোৱা বিপাকীয় পৰিৱৰ্তনৰ অনুসন্ধান কৰিবলৈ প্ৰেৰণা দিলে। আমি YFP (YFP +)-প্ৰকাশ পিএন (চিত্ৰ 1C) পৃথক কৰিবলৈ এটা প্ৰতিসৰণ-সক্ৰিয় কোষ সজাই পৰাই (FACS)-ভিত্তিক কৌশল বিকশিত, আৰু নিয়ন্ত্ৰণ এন্দুৰ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- বন্ধ-loxP: : L7-cre), ইয়াৰ পিছত CTRL (চিত্ৰ S1B) হিচাপে উল্লেখ কৰা হ'ব। ৱাইএফপি সংকেতৰ আপেক্ষিক তীব্ৰতাৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি গেটিং কৌশলৰ অনুকূলতাই আমাক নন-পিএন (YFPneg) (চিত্ৰ S1B) বা কল্পিত ফ্লু'ৰেচেণ্ট এক্সন/ডেণ্ড্ৰাইটিক খণ্ড (YFPlow; চিত্ৰ S1D, বাওঁফালে), কনফ'কেল মাইক্ৰস্কোপৰ দ্বাৰা নিশ্চিত কৰা (চিত্ৰ S1D, সোঁফালে)ৰ পৰা পিএনৰ YFP+ শৰীৰ (YFPhigh) বিশুদ্ধ কৰিবলৈ অনুমতি দিয়ে। শ্ৰেণীভুক্ত জনসংখ্যাৰ পৰিচয় পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি LFQ proteomics আৰু তাৰ পিছত প্ৰধান উপাদান বিশ্লেষণ কৰিলোঁ, আৰু দেখিলোঁ যে YFPhigh আৰু YFPneg কোষৰ মাজত স্পষ্ট পৃথকীকৰণ আছে (চিত্ৰ S1C)। YFPhigh কোষে জনা PNs মাৰ্কাৰ (অৰ্থাৎ Calb1, Pcp2, Grid2 আৰু Itpr3) (21, 22) ৰ এটা নেট সমৃদ্ধি দেখুৱাইছিল, কিন্তু সাধাৰণতে নিউৰন বা অন্য কোষ প্ৰকাৰত প্ৰকাশ পোৱা প্ৰটিনৰ কোনো সমৃদ্ধি দেখুৱাইছিল (চিত্ৰ 1D))। স্বতন্ত্ৰ পৰীক্ষাত সংগ্ৰহ কৰা শ্ৰেণীভুক্ত YFPhigh কোষৰ নমুনাৰ মাজত তুলনা কৰিলে এটা সম্পৰ্ক সহগ> 0.9 দেখা গৈছে, যিয়ে জৈৱিক প্ৰতিলিপিৰ মাজত ভাল প্ৰজনন ক্ষমতা প্ৰদৰ্শন কৰে (চিত্ৰ S1E)। সামৰণিত ক’বলৈ গ’লে এই তথ্যসমূহে সম্ভৱপৰ পিএনৰ তীব্ৰ আৰু নিৰ্দিষ্ট পৃথকীকৰণৰ বাবে আমাৰ পৰিকল্পনাক বৈধতা প্ৰদান কৰিলে। যিহেতু ব্যৱহৃত L7-cre ড্ৰাইভাৰ ব্যৱস্থাই প্ৰসৱৰ পিছত প্ৰথম সপ্তাহত মোজাইক পুনঃসংমিশ্ৰণ প্ৰৰোচিত কৰে (23), আমি CTRL আৰু চৰ্তযুক্ত (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) নিউৰন সংগ্ৰহৰ পৰা এন্দুৰক culling আৰম্ভ কৰিলোঁ। পুনঃসংমিশ্ৰণ সম্পূৰ্ণ হোৱাৰ পিছত ৪ সপ্তাহ বয়সত ইয়াক Mfn2cKO বুলি কোৱা হয়। শেষ বিন্দু হিচাপে আমি ৮ সপ্তাহ বয়স বাছি লৈছিলো যেতিয়া স্পষ্ট মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ খণ্ডিতকৰণৰ সত্ত্বেও পিএন স্তৰটো অক্ষত আছিল (চিত্ৰ ১বি আৰু চিত্ৰ এছ১এ)। মুঠতে আমি মুঠ ৩০১৩টা প্ৰটিনৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰিলোঁ, ইয়াৰে প্ৰায় ২২% মাইট’কণ্ড্ৰিয়া হিচাপে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল প্ৰটিঅ’মৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি মাইট’কাৰ্টা ২.০ টীকাকৰণৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি (চিত্ৰ ১ই) (চিত্ৰ ১ই) (২৪)। ৮ম সপ্তাহত কৰা ডিফাৰেন্সিয়েল জিন এক্সপ্ৰেচন বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে সকলো প্ৰটিনৰ মাত্ৰ ১০.৫%হে উল্লেখযোগ্য পৰিৱৰ্তন ঘটিছিল (চিত্ৰ ১F আৰু চিত্ৰ S1F), ইয়াৰে ১৯৫টা প্ৰটিন ডাউন-ৰেগুলেটেড আৰু ১২০টা প্ৰটিন আপ-ৰেগুলেটেড (চিত্ৰ ১F)। মন কৰিবলগীয়া যে এই তথ্যৰ সমষ্টিটোৰ “উদ্ভাৱন পথ বিশ্লেষণ”ই দেখুৱাইছে যে ভিন্নভাৱে প্ৰকাশ পোৱা জিনসমূহ মূলতঃ নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পথৰ এটা নিষিদ্ধ গোটৰ অন্তৰ্গত (চিত্ৰ ১জি)। আমোদজনকভাৱে, যদিও OXPHOS আৰু কেলচিয়াম সংকেতৰ সৈতে জড়িত পথসমূহৰ ডাউনৰেগুলেচনে সংযোজন-অভাৱী পিএনসমূহত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ অকাৰ্য্যকৰীতাৰ প্ৰৰোচনা নিশ্চিত কৰে, মূলতঃ এমিনো এচিড বিপাকীয় ক্ৰিয়া জড়িত অন্যান্য শ্ৰেণীসমূহ যথেষ্ট উৰ্ধনিয়ন্ত্ৰিত হয়, যিটো মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ সৈতে মিল খায় ৰিৱাইৰিং পিএন সামঞ্জস্যপূৰ্ণ। অকাৰ্য্যকৰীতা।
(A) CTRL আৰু Mfn2cKO এন্দুৰৰ চেৰিবেলাৰ অংশৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক কনফ'কেল ফটোগ্ৰাফ যিয়ে PNs (calbindin, gray)ৰ প্ৰগতিশীল ক্ষতি দেখুৱাইছে; নিউক্লিয়াছক ডি এ পি আইৰ দ্বাৰা কাউণ্টাৰষ্টেইন কৰা হৈছিল। (B) (A) ৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ, ***P<0.001; n = তিনিটা এন্দুৰৰ পৰা 4ৰ পৰা 6টা বৃত্ত)। (গ) পৰীক্ষামূলক কৰ্মপ্ৰবাহ। (ঘ) পুৰকিঞ্জে (ওপৰত) আৰু অন্যান্য কোষ প্ৰকাৰৰ (মাজত)ৰ বাবে নিৰ্দিষ্ট চিহ্নিতকাৰীৰ হিট মেপ বিতৰণ। (E) শ্ৰেণীভুক্ত পিএনত চিনাক্ত কৰা মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল প্ৰ’টিনৰ সংখ্যা দেখুওৱা ভেন ডায়াগ্ৰাম। (F) ৮ সপ্তাহত Mfn2cKO নিউৰনত ভিন্নভাৱে প্ৰকাশ পোৱা প্ৰটিনৰ আগ্নেয়গিৰিৰ প্লট (উল্লেখযোগ্যতা কাট-অফ মান ১.৩)। (G) সৃষ্টিশীলতা পথ বিশ্লেষণে ৮ সপ্তাহ হিচাপে শ্ৰেণীভুক্ত Mfn2cKO PN ত পাঁচটা আটাইতকৈ গুৰুত্বপূৰ্ণ আপ-ৰেগুলেচন (ৰঙা) আৰু ডাউন-ৰেগুলেচন (নীলা) পথ দেখুৱাইছে। ধৰা পৰা প্ৰতিটো প্ৰটিনৰ গড় প্ৰকাশৰ মাত্ৰা দেখুওৱা হৈছে। গ্ৰেস্কেল হিট মেপ: সমন্বিত পি মান। ns, গুৰুত্বপূৰ্ণ নহয়।
প্ৰটিঅ’মিক্সৰ তথ্যই দেখুৱাইছে যে কমপ্লেক্স I, III আৰু IV ৰ প্ৰটিনৰ প্ৰকাশ ক্ৰমান্বয়ে হ্ৰাস পাইছিল। কমপ্লেক্স I, III আৰু IV সকলোতে প্ৰয়োজনীয় mtDNA-এনকোড কৰা উপ-ইউনিট আছিল, আনহাতে কমপ্লেক্স II, যিটো কেৱল নিউক্লিয়াৰ-ক'ডযুক্ত আছিল, মূলতঃ প্ৰভাৱিত হোৱা নাছিল (চিত্ৰ 2A আৰু চিত্ৰ S2A)। . প্ৰটিঅ'মিক্সৰ ফলাফলৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে চেৰিবেলাৰ কলাৰ অংশৰ ইমিউন'হিষ্ট'কেমিষ্ট্ৰীয়ে দেখুৱাইছে যে পিএনত কমপ্লেক্স IV ৰ এমটিচিঅ'১ (মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল চাইট'ক্ৰ'ম চি অক্সিডেজ চাবইউনিট ১) উপ-ইউনিটৰ মাত্ৰা ক্ৰমান্বয়ে হ্ৰাস পায় (চিত্ৰ ২বি)। mtDNA-এনকোড কৰা উপ-ইউনিট Mtatp8 যথেষ্ট হ্ৰাস পাইছিল (চিত্ৰ S2A), আনহাতে নিউক্লিয়াৰ-এনকোড কৰা ATP চিনথেজ উপ-ইউনিটৰ স্থিৰ অৱস্থাৰ মাত্ৰা অপৰিৱৰ্তিত হৈ আছিল, যিটো mtDNA প্ৰকাশ সুস্থিৰ হ'লে জনা সুস্থিৰ ATP চিনথেজ চাবএছেম্বলি F1 কমপ্লেক্সৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণ। গঠনটো সামঞ্জস্যপূৰ্ণ। বাধা (৭)। বাস্তৱ সময়ৰ পলিমেৰেজ শৃংখলাবদ্ধ বিক্ৰিয়া (qPCR) দ্বাৰা সজাই পৰাই লোৱা Mfn2cKO PN সমূহত mtDNA মাত্ৰাৰ মূল্যায়নে mtDNA কপি সংখ্যা ক্ৰমান্বয়ে হ্ৰাস পোৱাটো নিশ্চিত কৰে। নিয়ন্ত্ৰণ গোটৰ তুলনাত ৮ সপ্তাহ বয়সত mtDNA ৰ মাত্ৰাৰ প্ৰায় ২০%হে ৰখা হৈছিল (চিত্ৰ ২C)। এই ফলাফলৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে, Mfn2cKO PNs ৰ কনফ'কেল মাইক্ৰস্কোপি ষ্টেইনিং ব্যৱহাৰ কৰি ডি এন এ ধৰা পেলোৱা হৈছিল, যিয়ে মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল নিউক্লিঅ'টাইডৰ সময়-নিৰ্ভৰশীল ব্যৱহাৰ দেখুৱাইছিল (চিত্ৰ ২D)। আমি দেখিলোঁ যে মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল প্ৰটিনৰ অৱক্ষয় আৰু চাপৰ প্ৰতিক্ৰিয়াৰ সৈতে জড়িত কিছুমান প্ৰাৰ্থীহে আপ-ৰেগুলেটেড আছিল, য'ত Lonp1, Afg3l2 আৰু Clpx, আৰু OXPHOS কমপ্লেক্স এছেম্বলি ফ্যাক্টৰসমূহো আছিল। এপ’প্টোছিছৰ লগত জড়িত প্ৰটিনৰ মাত্ৰাত কোনো বিশেষ পৰিৱৰ্তন ধৰা পৰা নাছিল (চিত্ৰ S2B)। একেদৰে আমি দেখিলোঁ যে কেলচিয়াম পৰিবহণৰ লগত জড়িত মাইট’কণ্ড্ৰিয়া আৰু এণ্ড’প্লাজমিক ৰেটিকুলাম চ্যানেলত সামান্য পৰিৱৰ্তনহে হয় (চিত্ৰ S2C)। ইয়াৰ উপৰিও অটোফেজি-সম্পৰ্কীয় প্ৰটিনৰ মূল্যায়নত কোনো উল্লেখযোগ্য পৰিৱৰ্তন পোৱা নগ'ল, যিটো ইমিউন'হিষ্ট'কেমিষ্ট্ৰী আৰু ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰস্কোপিৰ দ্বাৰা ইন ভিভ'ত পৰ্যবেক্ষণ কৰা অটোফেগ'জমৰ দৃশ্যমান প্ৰৰোচনাৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণ (চিত্ৰ S3)। কিন্তু পিএনসমূহত প্ৰগতিশীল অক্সফ’ছৰ বিসংগতিৰ লগে লগে স্পষ্ট আল্ট্ৰাষ্ট্ৰাকচাৰেল মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ পৰিৱৰ্তন ঘটে। ৫ আৰু ৮ সপ্তাহ বয়সৰ Mfn2cKO PN ৰ কোষ শৰীৰ আৰু ডেণ্ড্ৰাইটিক গছত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল থুপ দেখা যায় আৰু ভিতৰৰ পৰ্দাৰ গঠনত গভীৰ পৰিৱৰ্তন হৈছে (চিত্ৰ S4, A আৰু B)। এই আল্ট্ৰাষ্ট্ৰাকচাৰেল পৰিৱৰ্তন আৰু mtDNA ৰ যথেষ্ট হ্ৰাসৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে, টেট্ৰামিথাইলৰ'ডামাইন মিথাইল এষ্টাৰ (TMRM)ৰ সৈতে তীব্ৰ মস্তিষ্কৰ মস্তিষ্কৰ স্লাইচৰ বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে Mfn2cKO PNs ত মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল মেমব্ৰেনৰ সম্ভাৱনা যথেষ্ট হ্ৰাস পাইছে (চিত্ৰ S4C)।
(A) OXPHOS কমপ্লেক্সৰ প্ৰকাশৰ স্তৰৰ সময়ৰ গতি বিশ্লেষণ। কেৱল ৮ সপ্তাহত P<0.05 থকা প্ৰটিনৰ কথা বিবেচনা কৰক (দ্বিমুখী ANOVA)। বিন্দুযুক্ত ৰেখা: CTRL ৰ তুলনাত কোনো সালসলনি নাই। (খ) বাওঁফালে: এণ্টি-এমটিচিঅ’১ এন্টিব’ডি (স্কেল বাৰ, ২০ মাইক্ৰ’মিটাৰ) লেবেল কৰা মস্তিষ্কৰ অংশৰ উদাহৰণ। পুৰকিঞ্জে কোষৰ শৰীৰে দখল কৰা অঞ্চলটো হালধীয়া ৰঙেৰে আবৃত। সোঁফালে: MTCO1 মাত্ৰাৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ; n = তিনিটা এন্দুৰৰ পৰা বিশ্লেষণ কৰা ৭ৰ পৰা ২০টা কোষ)। (C) সজাই থোৱা পিএনত mtDNA কপি সংখ্যাৰ qPCR বিশ্লেষণ (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ; n = 3ৰ পৰা 7টা এন্দুৰ)। (ঘ) বাওঁফালে: এণ্টি-ডি এন এ এন্টিব’ডি (স্কেল বাৰ, ২০ মাইক্ৰ’মিটাৰ) লেবেলযুক্ত চেৰিবেলাৰ স্লাইচৰ উদাহৰণ। পুৰকিঞ্জে কোষৰ শৰীৰে দখল কৰা অঞ্চলটো হালধীয়া ৰঙেৰে আবৃত। সোঁফালে: mtDNA ক্ষতৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ; n = তিনিটা এন্দুৰৰ পৰা ৫ৰ পৰা ৯টা কোষ)। (E) গোটেই কোষৰ পেচ ক্লেম্প ৰেকৰ্ডিঙত মাইট’ৱাইএফপি + পাৰ্কিঞ্জে কোষ (তীৰ চিহ্ন) দেখুওৱা এটা তীব্ৰ মস্তিষ্কৰ অংশৰ উদাহৰণ। (F) IV বক্ৰৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয়। (G) CTRL আৰু Mfn2cKO Purkinje কোষত ডিপ'লাৰাইজিং কাৰেণ্ট ইনজেকচনৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক ৰেকৰ্ডিং। শীৰ্ষ ট্ৰেচ: এ পি ট্ৰিগাৰ কৰা প্ৰথম পালছ। তলৰ ট্ৰেচ: সৰ্বোচ্চ এ পি কম্পাঙ্ক। (H) পষ্টচিনেপ্টিক স্বতঃস্ফূৰ্ত ইনপুট (sPSPs)ৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয়। প্ৰতিনিধিত্বমূলক ৰেকৰ্ডিং ট্ৰেচ আৰু ইয়াৰ জুম অনুপাত (I) ত দেখুওৱা হৈছে। ভ্যাৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণে তিনিটা এন্দুৰৰ পৰা n = ৫ৰ পৰা ২০টা কোষ বিশ্লেষণ কৰিছিল। তথ্যসমূহ গড়±SEM হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়; *পি<০.০৫; **পি<০.০১; ***পি<০.০০১। (J) ছিদ্ৰযুক্ত পেচ ক্লেম্প মোড ব্যৱহাৰ কৰি ৰেকৰ্ড কৰা স্বতঃস্ফূৰ্ত এ পিৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক ট্ৰেচ। শীৰ্ষ ট্ৰেচ: সৰ্বোচ্চ এ পি কম্পাঙ্ক। তলৰ ট্ৰেচ: এটা এপিৰ জুম। (K) (J) অনুসৰি গড় আৰু সৰ্বোচ্চ এ পি কম্পাঙ্ক পৰিমাণীকৰণ কৰা। মান-হুইটনী পৰীক্ষা; চাৰিটা এন্দুৰৰ পৰা n = ৫টা কোষ বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। তথ্যসমূহ গড়±SEM হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়; গুৰুত্বপূৰ্ণ নহয়।
৮ সপ্তাহ পুৰণি Mfn2cKO PN ত স্পষ্ট OXPHOS ক্ষতি ধৰা পৰিছিল, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে নিউৰনৰ শাৰীৰিক কাৰ্য্য গুৰুতৰভাৱে অস্বাভাৱিক। সেয়েহে আমি তীব্ৰ মস্তিষ্কৰ স্লাইচত গোটেই কোষৰ পেচ ক্লেম্প ৰেকৰ্ডিং কৰি ৪ৰ পৰা ৫ সপ্তাহ আৰু ৭ৰ পৰা ৮ সপ্তাহত OXPHOS-অভাৱী নিউৰনৰ নিষ্ক্ৰিয় বৈদ্যুতিক বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ কৰিলোঁ (চিত্ৰ ২E)। অপ্ৰত্যাশিতভাৱে, Mfn2cKO নিউৰনৰ গড় জিৰণি লোৱা মেমব্ৰেন সম্ভাৱনা আৰু ইনপুট প্ৰতিৰোধ ক্ষমতা নিয়ন্ত্ৰণৰ দৰেই আছিল, যদিও কোষৰ মাজত সূক্ষ্ম পাৰ্থক্য আছিল (তালিকা ১)। একেদৰে ৪ৰ পৰা ৫ সপ্তাহ বয়সত কাৰেণ্ট-ভোল্টেজ সম্পৰ্ক (IV curve)ৰ কোনো বিশেষ পৰিৱৰ্তন পোৱা নগ’ল (চিত্ৰ ২F)। কিন্তু ৭ৰ পৰা ৮ সপ্তাহ বয়সৰ কোনো Mfn2cKO নিউৰনে IV ৰেজিমেন (হাইপাৰপ’লাৰাইজেচন ষ্টেপ)ৰ পৰা বাচি নাথাকিল, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে এই শেষৰ পৰ্যায়ত হাইপাৰপ’লাৰাইজেচন সম্ভাৱনাৰ প্ৰতি স্পষ্ট সংবেদনশীলতা আছে। ইয়াৰ বিপৰীতে Mfn2cKO নিউৰনত পুনৰাবৃত্তিমূলক ক্ৰিয়া সম্ভাৱনা (AP) নিৰ্গমনৰ সৃষ্টি কৰা বিমেৰুকৰণ কাৰেণ্ট ভালদৰে সহ্য কৰা হয়, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে ইয়াৰ সামগ্ৰিক নিৰ্গমনৰ ধৰণ ৮ সপ্তাহ পুৰণি নিয়ন্ত্ৰণ নিউৰনৰ পৰা বিশেষভাৱে পৃথক নহয় (তালিকা ১ আৰু চিত্ৰ ২G)। একেদৰে স্বতঃস্ফূৰ্ত পোষ্টচিনেপ্টিক কাৰেণ্ট (sPSCs)ৰ কম্পাঙ্ক আৰু প্ৰসাৰণ নিয়ন্ত্ৰণ গোটৰ সৈতে তুলনাযোগ্য আছিল আৰু একেধৰণৰ বৃদ্ধিৰ সৈতে ৪ সপ্তাহৰ পৰা ৫ সপ্তাহৰ পৰা ৭ সপ্তাহৰ পৰা ৮ সপ্তাহলৈকে পৰিঘটনাৰ কম্পাঙ্ক বৃদ্ধি পাইছিল (চিত্ৰ ২, H আৰু I)। পিএনসমূহত চিনেপ্টিক পৰিপক্কতাৰ সময়ছোৱা (২৫)। ছিদ্ৰযুক্ত পিএনএছ পেচৰ পিছতো একেধৰণৰ ফলাফল পোৱা গৈছিল। এই বিন্যাসে কোষীয় ATP দোষৰ সম্ভাৱ্য ক্ষতিপূৰণ বাধা দিয়ে, যেনে গোটেই-কোষ পেচ ক্লেম্প ৰেকৰ্ডিঙত হ'ব পাৰে। বিশেষকৈ, Mfn2cKO নিউৰনৰ জিৰণি লোৱা মেমব্ৰেনৰ সম্ভাৱনা আৰু স্বতঃস্ফূৰ্তভাৱে গুলী চলোৱাৰ কম্পাঙ্কত কোনো প্ৰভাৱ পৰা নাছিল (চিত্ৰ ২, জে আৰু কে)। সামৰণিত ক’বলৈ গ’লে এই ফলাফলসমূহে ইংগিত দিয়ে যে স্পষ্ট অক্সফ’ছৰ বিসংগতি থকা পিএনসমূহে উচ্চ কম্পাঙ্ক নিৰ্গমনৰ আৰ্হিৰ সৈতে ভালদৰে মোকাবিলা কৰিব পাৰে, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে এটা ক্ষতিপূৰণ ব্যৱস্থা আছে যিয়ে তেওঁলোকক প্ৰায় স্বাভাৱিক ইলেক্ট্ৰ’ফিজিঅ’লজিকেল প্ৰতিক্ৰিয়া বজাই ৰাখিবলৈ অনুমতি দিয়ে।
তথ্যসমূহ গড় ± SEM (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ, হোম-চিডাকৰ বহুবিধ তুলনা পৰীক্ষা; *P<0.05) হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়। ইউনিট নম্বৰটো বন্ধনীৰে সূচনা কৰা হৈছে।
আমি প্ৰটিঅ'মিক্স ডাটাছেট (চিত্ৰ ১জি)ৰ যিকোনো শ্ৰেণীত গুৰুতৰ OXPHOS অভাৱ প্ৰতিহত কৰিব পৰা পথ অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হৈছে নেকি সেই বিষয়ে অনুসন্ধান কৰিবলৈ ওলাইছিলো, যাৰ ফলত প্ৰভাৱিত পিএনে কিয় প্ৰায় স্বাভাৱিক ইলেক্ট্ৰ'ফিজিঅ'লজি বজাই ৰাখিব পাৰে (চিত্ৰ ২, ইৰ পৰা কে) সেই বিষয়ে ব্যাখ্যা কৰিছিল। . প্ৰটিঅ'মিক্স বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে শাখাযুক্ত শৃংখলাবদ্ধ এমিনো এচিড (BCAA)ৰ কেটাবলিজমৰ লগত জড়িত এনজাইমসমূহ যথেষ্ট পৰিমাণে আপ-ৰেগুলেটেড আছিল (চিত্ৰ ৩A আৰু চিত্ৰ S5A), আৰু চূড়ান্ত উৎপাদন এচিটাইল-কোএ (CoA) বা ছাক্সিনাইল কোএ আৰ্টেৰিয়াস্কলেৰচিছ এচিড (টিচিএ) চক্ৰত ট্ৰাইকাৰ্বক্সিলেটৰ পৰিপূৰক হ'ব পাৰে। আমি দেখিলোঁ যে বিচিএএ ট্ৰেন্সএমিনেজ ১ (বিচিএটি১) আৰু বিচিএটি২ দুয়োটাৰে পৰিমাণ বৃদ্ধি পায়। তেওঁলোকে α-কেট’গ্লুটাৰেটৰ পৰা গ্লুটামেট উৎপন্ন কৰি বিচিএএ কেটাবলিজমৰ প্ৰথম পদক্ষেপটোক অনুঘটক হিচাপে কাম কৰে (২৬)। শাখাযুক্ত শৃংখল কিট' এচিড ডিহাইড্ৰ'জেনেজ (BCKD) কমপ্লেক্স গঠন কৰা সকলো উপ-ইউনিট উৰ্ধনিয়ন্ত্ৰিত হয় (কম্প্লেক্সে ফলস্বৰূপে বিচিএএ কাৰ্বন কংকালৰ পৰৱৰ্তী আৰু অপ্ৰত্যাৱৰ্তনীয় ডিকাৰ্বক্সিলেচনক অনুঘটক হিচাপে কাম কৰে) (চিত্ৰ ৩A আৰু চিত্ৰ S5A)। কিন্তু বিচিএএৰ নিজেই কোনো স্পষ্ট পৰিৱৰ্তন পোৱা নগ’ল, যিটো এই প্ৰয়োজনীয় এমিনো এচিডসমূহৰ কোষীয় গ্ৰহণ বৃদ্ধি বা টিচিএ চক্ৰৰ পৰিপূৰক হিচাপে অন্য উৎস (গ্লুক’জ বা লেক্টিক এচিড)ৰ ব্যৱহাৰৰ বাবে হ’ব পাৰে (চিত্ৰ S5B)। OXPHOS ৰ অভাৱত থকা পিএনসমূহেও ৮ সপ্তাহ বয়সত গ্লুটামাইনৰ বিয়োজন আৰু ট্ৰেন্সএমিনেচন কাৰ্য্যকলাপ বৃদ্ধি কৰা দেখা যায়, যিটো মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল এনজাইম গ্লুটামিনেজ (GLS) আৰু গ্লুটামাইন পাইৰুভেট ট্ৰেন্সএমিনেজ ২ (GPT2)ৰ আপ-ৰেগুলেচনৰ দ্বাৰা প্ৰতিফলিত হ’ব পাৰে (চিত্ৰ ৩, এ আৰু চি)। মন কৰিবলগীয়া যে জিএলএছৰ আপ-ৰেগুলেচন স্প্লাইচড আইছ'ফৰ্ম গ্লুটামিনেজ চি (জিএলএছ-জিএচি)ত সীমাবদ্ধ (Mfn2cKO/CTRLৰ পৰিৱৰ্তন প্ৰায় ৪.৫গুণ, P = ০.০৫), আৰু কেন্সাৰ কলাত ইয়াৰ নিৰ্দিষ্ট আপ-ৰেগুলেচনে মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ জৈৱশক্তিক সমৰ্থন কৰিব পাৰে। (২৭)।
(A) হিট মেপত ৮ সপ্তাহত নিৰ্দিষ্ট পথৰ বাবে প্ৰটিনৰ মাত্ৰাৰ ভাঁজ পৰিৱৰ্তন দেখুওৱা হৈছে। (B) এণ্টি-পিচিএক্স এন্টিব’ডি (স্কেল বাৰ, ২০ মাইক্ৰ’মিটাৰ) লেবেলযুক্ত চেৰিবেলাৰ স্লাইচৰ উদাহৰণ। হালধীয়া কাঁড় চিহ্নটোৱে পুৰকিঞ্জে কোষৰ শৰীৰটোলৈ আঙুলিয়াই দিয়ে। (C) এথেৰ'স্কলেৰচিছৰ বাবে গুৰুত্বপূৰ্ণ প্ৰাৰ্থী হিচাপে চিনাক্ত কৰা সময়ৰ গতিপথ প্ৰটিন প্ৰকাশ বিশ্লেষণ (একাধিক t-টেষ্ট, *FDR <5%; n = 3-5 এন্দুৰ)। (ঘ) ওপৰত: [1-13C]পাইৰুভেট ট্ৰেচাৰত থকা লেবেলযুক্ত কাৰ্বন প্ৰৱেশৰ বিভিন্ন উপায় দেখুওৱা এটা আঁচনিমূলক ডায়াগ্ৰাম (অৰ্থাৎ, পিডিএইচ বা ট্ৰেন্স-আৰ্টেৰিয়েল পথৰ জৰিয়তে)। তলত: ভায়লিন চাৰ্টত তীব্ৰ মস্তিষ্কৰ স্লাইচবোৰক [1-13C]পাইৰুভেটৰ সৈতে লেবেল লগোৱাৰ পিছত এছপাৰটিক এচিড, চাইট্ৰিক এচিড আৰু মেলিক এচিডলৈ ৰূপান্তৰিত একক-লেবেলযুক্ত কাৰ্বন (M1)ৰ শতকৰা হাৰ দেখুওৱা হৈছে (যোৰযুক্ত t-পৰীক্ষা; ** P <0.01)। (ঙ) নিৰ্দিষ্ট পথৰ বিস্তৃত সময় ইতিহাস বিশ্লেষণ। ৮ সপ্তাহত P<0.05 থকা প্ৰটিনহে বিবেচনা কৰক। ডেচ লাইন: কোনো সমন্বয় মান নাই (ভ্যাৰিয়েন্সৰ দুমুখীয়া বিশ্লেষণ; * P <0.05; *** P <0.001)। তথ্যসমূহ গড়±SEM হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়।
আমাৰ বিশ্লেষণত বিচিএএ কেটাবলিজম অন্যতম মূল আপ-ৰেগুলেচন পথত পৰিণত হৈছে। এই তথ্যই দৃঢ়ভাৱে প্ৰকাশ কৰে যে অক্সফ’ছৰ অভাৱত পিএনত টিচিএ চক্ৰত প্ৰৱেশ কৰা ভেণ্টিলেচনৰ আয়তন সলনি হ’ব পাৰে। ই স্নায়ুকোষীয় বিপাকীয় তাঁৰ সংযোগৰ এটা প্ৰধান ৰূপক প্ৰতিনিধিত্ব কৰিব পাৰে, যিয়ে গুৰুতৰ OXPHOS অকাৰ্য্যকৰীতা বজাই ৰখাৰ সময়ত স্নায়ুকোষীয় শৰীৰবিজ্ঞান আৰু জীয়াই থকাৰ ওপৰত প্ৰত্যক্ষ প্ৰভাৱ পেলাব পাৰে। এই ধাৰণাটোৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে আমি দেখিলোঁ যে মূল এন্টি-এথেৰ'স্কলেৰটিক এনজাইম PCx আপ-ৰেগুলেটেড (Mfn2cKO/CTRL প্ৰায় ১.৫ বাৰ পৰিৱৰ্তন হয়; চিত্ৰ ৩A), যিয়ে পাইৰুভেটৰ অক্সালোএচিটেটলৈ ৰূপান্তৰিত হোৱাৰ অনুঘটক হিচাপে কাম কৰে (২৮), যিটো মগজুৰ কলাত থকা বুলি বিশ্বাস কৰা হয়। প্ৰটিঅ'মিক্সৰ ফলাফলৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণভাৱে কনফ'কেল মাইক্ৰস্কোপিয়ে দেখুৱাইছে যে OXPHOS-অভাৱী পিএনসমূহত পিচিএক্স প্ৰকাশ বিশেষভাৱে আৰু যথেষ্ট বৃদ্ধি পায়, আনহাতে পিচিএক্সৰ বিক্ৰিয়াশীলতা মূলতঃ নিয়ন্ত্ৰণৰ কাষৰীয়া বাৰ্গমেন গ্লিয়াল কোষত সীমাবদ্ধ আছিল (চিত্ৰ ৩বি)। PCx ৰ পৰ্যবেক্ষণ কৰা উৰ্ধ নিয়ন্ত্ৰণ কাৰ্য্যক্ষমভাৱে পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি তীব্ৰ মস্তিষ্কৰ স্লাইচসমূহক [1-13C]পাইৰুভেট ট্ৰেচাৰৰ দ্বাৰা চিকিৎসা কৰিলোঁ। পাইৰুভেট ডিহাইড্ৰ'জেনেজ (PDH) দ্বাৰা অক্সিডাইজ হোৱাৰ পিছত ইয়াৰ আইছ'ট'প লেবেল নোহোৱা হৈ যায়, কিন্তু পাইৰুভেট ভেছকুলাৰ বিক্ৰিয়াৰ দ্বাৰা বিপাকীয় ক্ৰিয়া হ'লে TCA চক্ৰৰ মধ্যৱৰ্তী পদাৰ্থত অন্তৰ্ভুক্ত হয় (চিত্ৰ ৩D)। আমাৰ প্ৰটিঅ'মিক্স তথ্যৰ সমৰ্থনত আমি Mfn2cKO স্লাইচৰ এছপাৰটিক এচিডত এই ট্ৰেচাৰৰ পৰা বৃহৎ সংখ্যক মাৰ্কাৰ পৰ্যবেক্ষণ কৰিলোঁ, আনহাতে চাইট্ৰিক এচিড আৰু মেলিক এচিডৰ মাজতো মধ্যমীয়া ধাৰা আছিল, যদিও গুৰুত্বপূৰ্ণ নাছিল (চিত্ৰ ৩D)।
ড'পামিন নিউৰনে বিশেষভাৱে মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল ট্ৰান্সক্ৰিপচন ফ্যাক্টৰ এ জিন (Tfam) ধ্বংস কৰাৰ ফলত হোৱা মাইট'পাৰ্ক এন্দুৰৰ ড'পামিন নিউৰনত (চিত্ৰ S6B), পিচিএক্স প্ৰকাশও যথেষ্ট পৰিমাণে আপ-ৰেগুলেটেড হৈছিল (31), ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে এচিটন এচিড ধমনীস্কলেৰ'ছিছ নিউৰনেলৰ অকাৰ্য্যকৰীতাৰ সময়ত ৰোগৰ সংঘটন নিয়ন্ত্ৰিত হয় শৰীৰত OXPHOS। মন কৰিবলগীয়া যে ধমনী স্ক্লেৰচিছৰ সৈতে জড়িত হ’ব পৰা নিউৰনত প্ৰকাশ পাব পৰা অনন্য এনজাইম (৩২-৩৪) OXPHOS ৰ অভাৱত থকা পিএনসমূহত যথেষ্ট পৰিমাণে আপ-ৰেগুলেটেড হয়, যেনে প্ৰপিয়নাইল-কোএ কাৰ্বক্সিলেজ (PCC-A), মেল’নাইল-কোএ প্ৰপিঅ’নাইল-কোএক ছাক্সিনাইল-কোএ আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল মেলিক এনজাইম ৩ (ME3)লৈ ৰূপান্তৰিত কৰে। যাৰ মূল ভূমিকা হৈছে মেলেটৰ পৰা পাইৰুভেট উদ্ধাৰ কৰা (চিত্ৰ ৩, ক আৰু গ) (৩৩, ৩৫)। ইয়াৰ উপৰিও আমি Pdk3 এনজাইমত যথেষ্ট বৃদ্ধি পোৱা দেখিলোঁ, যিয়ে PDHক ফচফৰাইল কৰে আৰু এইদৰে PDH নিষ্ক্ৰিয় কৰে (36), আনহাতে PDH বা PDH এনজাইম কমপ্লেক্সটো সক্ৰিয় কৰা Pdp1 এনজাইমত কোনো পৰিৱৰ্তন ধৰা পৰা নাছিল (চিত্ৰ 3A)। ধাৰাবাহিকভাৱে, Mern2cKO PNs ত, Ser293 ত PDH কমপ্লেক্সৰ পাইৰুভেট ডিহাইড্ৰ'জেনেজ E1 উপাদানৰ α1 উপ-ইউনিট α (PDHE1α) উপ-ইউনিটৰ ফচফৰাইলেচন বৃদ্ধি পাইছিল (চিত্ৰ S6C) (চিত্ৰ S6C)। পাইৰুভেটৰ কোনো ভেছকুলাৰ প্ৰৱেশ নাই।
শেষত আমি দেখিলোঁ যে চেৰিন আৰু গ্লাইচিন জৈৱসংশ্লেষণৰ ছুপাৰ পথ, আনুষংগিক মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল ফ’লেট (১চি) চক্ৰ আৰু প্ৰ’লিন জৈৱসংশ্লেষণ (চিত্ৰ ১জি আৰু চিত্ৰ S5C) সকলোবোৰ সক্ৰিয়কৰণ প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত প্ৰতিবেদন অনুসৰি যথেষ্ট পৰিমাণে আপ-ৰেগুলেটেড হয়। মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ ফলত চাৰিওফালৰ কলাবোৰ সক্ৰিয় হয় (৫-৭)। এই প্ৰটিঅ'মিক্স তথ্য সমৰ্থন কৰা কনফ'কেল বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে OXPHOS অনুপস্থিত থকা পিএনত ৮ সপ্তাহ বয়সৰ এন্দুৰৰ চেৰিবেলাৰ স্লাইচক মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল ফ'লেট চক্ৰৰ এটা মূল এনজাইম চেৰিন হাইড্ৰক্সিমিথাইলট্ৰেন্সফেৰেজ ২ (SHMT2)ৰ বলি কৰা হৈছিল। উল্লেখযোগ্য প্ৰতিৰোধ ক্ষমতাৰ সঁহাৰি (চিত্ৰ S5D)। 13 টা CU-গ্লুক'জ-ইনকিউবেট কৰা তীব্ৰ চেৰিবেলাৰ স্লাইচত বিপাকীয় ট্ৰেচিং পৰীক্ষাই চেৰিন আৰু প্ৰ'লিন জৈৱসংশ্লেষণৰ আপ-ৰেগুলেচন আৰু অধিক নিশ্চিত কৰে, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে চেৰিন আৰু প্ৰ'লিনলৈ কাৰ্বন আইছ'ফৰ্মৰ প্ৰবাহ বৃদ্ধি পায় (চিত্ৰ S5E)। GLS আৰু GPT2 দ্বাৰা প্ৰসাৰিত বিক্ৰিয়াসমূহ গ্লুটামাইনৰ পৰা গ্লুটামেটৰ সংশ্লেষণ আৰু গ্লুটামেট আৰু α-কেট'গ্লুটাৰেটৰ মাজৰ ট্ৰেন্সএমিনেচনৰ বাবে দায়বদ্ধ, ইয়াৰ উৰ্ধ নিয়ন্ত্ৰণে ইংগিত দিয়ে যে OXPHOS-অভাৱী নিউৰনসমূহৰ গ্লুটামেটৰ চাহিদা বৃদ্ধি পায়, ইয়াৰ লক্ষ্য প্ৰ'লিনৰ বৃদ্ধি পোৱা জৈৱসংশ্লেষণ বজাই ৰখা হ'ব পাৰে (চিত্ৰ S5C)। এই পৰিৱৰ্তনৰ বিপৰীতে, পিএন-নিৰ্দিষ্ট Mfn2cKO এন্দুৰৰ পৰা চেৰিবেলাৰ এষ্ট্ৰ'চাইটৰ এটা প্ৰটিঅ'মিক বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে এই পথসমূহ (সকলো এন্টিপেৰাঅক্সিডেজকে ধৰি) প্ৰকাশৰ ক্ষেত্ৰত বিশেষ পৰিৱৰ্তন হোৱা নাছিল, যাৰ ফলত এই বিপাকীয় পুনঃনিৰ্দেশন অৱক্ষয়ী পিএন (চিত্ৰ S6, D ৰ পৰা G)ৰ বাবে নিৰ্বাচিত।
সামৰণিত ক’বলৈ গ’লে এই বিশ্লেষণসমূহে পিএনসমূহত নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পথসমূহৰ কালিক সক্ৰিয়কৰণৰ যথেষ্ট ভিন্ন আৰ্হি উন্মোচন কৰে। যদিও অস্বাভাৱিক স্নায়ুকোষীয় মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ কাৰ্য্যই আৰম্ভণিতে এথেৰ'স্কলেৰ'ছিছ আৰু 1C পুনৰ নিৰ্মাণৰ সৃষ্টি কৰিব পাৰে (চিত্ৰ 3E আৰু চিত্ৰ S5C), আৰু আনকি I আৰু IV কমপ্লেক্সৰ প্ৰকাশৰ ভৱিষ্যদ্বাণীযোগ্য পৰিৱৰ্তন, চেৰিন ডি ন'ভ' সংশ্লেষণৰ পৰিৱৰ্তন কেৱল শেষৰ পৰ্যায়তহে স্পষ্ট হৈ পৰিছিল। OXPHOS ৰ অকাৰ্য্যকৰীতা (চিত্ৰ 3E আৰু চিত্ৰ S5C)। এই তথ্যসমূহে এটা ক্ৰমিক প্ৰক্ৰিয়াৰ সংজ্ঞা দিয়ে য’ত চাপ-প্ৰৰোচিত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল (১চি চক্ৰ) আৰু চাইট’প্লাজমিক (চেৰিন বায়’চিন্থেছিছ) টিচিএ চক্ৰত এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছ বৃদ্ধিৰ সৈতে সহযোগিতামূলকভাৱে সঁহাৰি জনাই স্নায়ুকোষীয় বিপাকীয় ক্ৰিয়াক পুনৰ গঠন কৰে।
৮ সপ্তাহ পুৰণি OXPHOS-অভাৱী পিএনসমূহে উচ্চ কম্পাঙ্ক উত্তেজনা কাৰ্য্যকলাপ বজাই ৰাখিব পাৰে আৰু মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ ক্ষতিপূৰণ দিবলৈ উল্লেখযোগ্য বিপাকীয় পুনৰ সংযোগৰ সন্মুখীন হ’ব পাৰে। এই আৱিষ্কাৰে এটা আকৰ্ষণীয় সম্ভাৱনা উত্থাপন কৰিছে যে এই মুহূৰ্ততো এই কোষবোৰে স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ত বিলম্ব বা প্ৰতিৰোধ কৰিবলৈ চিকিৎসামূলক হস্তক্ষেপ লাভ কৰিব পাৰে। পলম। আমি দুটা স্বতন্ত্ৰ হস্তক্ষেপৰ জৰিয়তে এই সম্ভাৱনা সমাধান কৰিলোঁ। প্ৰথম পদ্ধতিত আমি এটা Cre-নিৰ্ভৰশীল এডিন’-সংলগ্ন ভাইৰাছ (AAV) ভেক্টৰ ডিজাইন কৰিলোঁ যাতে MFN2ক ইন ভিভ’ত OXPHOS-অভাৱী পিএনসমূহত নিৰ্বাচিতভাৱে প্ৰকাশ কৰিব পৰা যায় (চিত্ৰ S7A)। MFN2 আৰু ফ্লু'ৰেচেণ্ট ৰিপ'ৰ্টাৰ জিন mCherry (Mfn2-AAV) এনকোডিং কৰা AAV ইন ভিট্ৰ'ত প্ৰাথমিক নিউৰন কালচাৰত পৰীক্ষা কৰা হৈছিল, যাৰ ফলত MFN2 Cre-নিৰ্ভৰশীলভাৱে প্ৰকাশ পাইছিল আৰু মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ মৰ্ফ'লজী উদ্ধাৰ কৰিছিল, যাৰ ফলত Mfn2cKO নিউৰনত নিউৰ'মিউটেচন ৰোধ কৰা হৈছিল (চিত্ৰ S7, B, D আৰু E)। তাৰ পিছত, আমি ষ্টেৰিঅ'টেকটিকভাৱে Mfn2cKO আৰু নিয়ন্ত্ৰণ এন্দুৰৰ চেৰিবেলাৰ কৰ্টেক্সলৈ ৮ সপ্তাহ বয়সৰ Mfn2-AAV প্ৰদান কৰিবলৈ ইন ভিভ' পৰীক্ষা চলাইছিলো, আৰু ১২ সপ্তাহ বয়সৰ এন্দুৰ বিশ্লেষণ কৰিছিলোঁ (চিত্ৰ ৪A)। চিকিৎসা কৰা Mfn2cKO এন্দুৰৰ মৃত্যু হয় (চিত্ৰ ১, ক আৰু খ) (১৬)। ইন ভিভ'ত ভাইৰাছৰ ট্ৰান্সডাকচনৰ ফলত কিছুমান চেৰিবেলাৰ বৃত্তত পিএনৰ নিৰ্বাচিত প্ৰকাশ হয় (চিত্ৰ S7, G আৰু H)। কেৱল mCherry (Ctrl-AAV) প্ৰকাশ কৰা নিয়ন্ত্ৰণ AAV ৰ বেজী দিলে Mfn2cKO প্ৰাণীৰ স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ৰ মাত্ৰাত কোনো বিশেষ প্ৰভাৱ পৰা নাছিল। ইয়াৰ বিপৰীতে Mfn2-AAV ৰ সৈতে ট্ৰেন্সডুচ কৰা Mfn2cKOs ৰ বিশ্লেষণে পিএন কোষ স্তৰৰ উল্লেখযোগ্য সুৰক্ষামূলক প্ৰভাৱ দেখুৱাইছে (চিত্ৰ ৪, বি আৰু চি)। বিশেষকৈ নিউৰনৰ ঘনত্ব নিয়ন্ত্ৰণ প্ৰাণীৰ পৰা প্ৰায় পৃথক কৰিব নোৱাৰা যেন লাগে (চিত্ৰ ৪, B আৰু C, আৰু চিত্ৰ S7, H আৰু I)। MFN1 ৰ প্ৰকাশ কিন্তু MFN2 নহয় স্নায়ুকোষৰ মৃত্যু ৰক্ষা কৰাত সমানে ফলপ্ৰসূ (চিত্ৰ ৪C আৰু চিত্ৰ S7, C আৰু F), যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে এক্ট’পিক MFN1ৰ প্ৰকাশে MFN2ৰ অভাৱক ফলপ্ৰসূভাৱে পৰিপূৰক কৰিব পাৰে। একক পিএন স্তৰত অধিক বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে Mfn2-AAV এ মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ আল্ট্ৰাষ্ট্ৰাকচাৰ বহুলাংশে উদ্ধাৰ কৰে, mtDNA মাত্ৰা স্বাভাৱিক কৰে আৰু এণ্টি-এঞ্জিওজেনেছিছ মাৰ্কাৰ PCx (চিত্ৰ ৪, C ৰ পৰা E)ৰ উচ্চ প্ৰকাশ উলটি দিয়ে। উদ্ধাৰ কৰা Mfn2cKO এন্দুৰবোৰৰ জিৰণিৰ অৱস্থাত দৃশ্যমান পৰিদৰ্শন কৰিলে দেখা গ’ল যে ইহঁতৰ ভংগীমা আৰু মটৰ লক্ষণ (S1ৰ পৰা S3লৈ গতি) উন্নত হৈছে। সামৰণিত এই পৰীক্ষাসমূহে দেখুৱাইছে যে OXPHOS ৰ গুৰুতৰ অভাৱ থকা পিএনসমূহত MFN2 ৰ পলমকৈ পুনৰ প্ৰৱেশ কৰাটোৱে mtDNA ব্যৱহাৰক ওলোটা কৰিবলৈ আৰু এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছৰ সৃষ্টি কৰিবলৈ যথেষ্ট, যাৰ ফলত ইন ভিভ’ত এক্সন অৱক্ষয় আৰু স্নায়ুকোষৰ মৃত্যু ৰোধ কৰা হয়।
(ক) নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পথ সক্ৰিয় হ’লে MFN2 এনকোডিং কৰা AAV বেজী দিয়াৰ পৰীক্ষামূলক সময়সূচী দেখুওৱা এখন আঁচনি। (B) Mfn2cKO এন্দুৰত ৮ সপ্তাহত ট্ৰেন্সডুচ কৰা আৰু এণ্টি-কেলবিণ্ডিন এন্টিব’ডিৰে লেবেল কৰা ১২ সপ্তাহ বয়সৰ চেৰিবেলাৰ স্লাইচৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক কনফ’কেল ছবি। সোঁফালে: এক্সন আঁহৰ স্কেলিং। এক্সন জুমৰ স্কেল ৪৫০ আৰু ৭৫ মাইক্ৰ’মিটাৰ। (C) বাওঁফালে: AAV ট্ৰেন্সডাকচন লুপ (AAV+) ত Purkinje কোষ ঘনত্বৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ; n = 3 এন্দুৰ)। সোঁফালে: ১২ সপ্তাহত ট্ৰেন্সডুচড পিএনত mtDNA ফ'কাচ বিশ্লেষণ (অযোৰযুক্ত টি-টেষ্ট; তিনিটা এন্দুৰৰ পৰা n = ৬টা কোষ)। * পি <০.০৫; ** পি <০.০১। (ঘ) নিৰ্দিষ্ট ভাইৰাছৰ ভেক্টৰৰ সৈতে ট্ৰেন্সডুচ কৰা Mfn2cKO চেৰিবেলাৰ অংশৰ পিএনৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক সংক্ৰমণ ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰ'গ্ৰাফ। গোলাপী ৰঙৰ মাস্কে ডেণ্ড্ৰাইটে দখল কৰা অঞ্চলটো দেখুৱাইছে আৰু হালধীয়া বিন্দুযুক্ত বৰ্গক্ষেত্ৰখনে সোঁফালে দিয়া জুমটো দেখুৱাইছে; n য়ে নিউক্লিয়াছক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। স্কেল বাৰ, ১μm। (E) ত ১২ সপ্তাহত ট্ৰেন্সডুচ কৰা পিএনত পিচিএক্স ষ্টেইনিঙৰ উদাহৰণ দেখুওৱা হৈছে। স্কেল বাৰ, ২০μm। OE, অতিমাত্ৰা প্ৰকাশ; এফ চি, ভাঁজ সলনি কৰা।
শেষত আমি OXPHOS বিসংগতিৰ সন্মুখীন হোৱা পিএনসমূহত পেৰাক্সিডেজ-প্ৰৰোচিত কোষৰ জীয়াই থকাৰ গুৰুত্বৰ বিষয়ে অনুসন্ধান কৰিলোঁ। আমি বিশেষভাৱে মাউছ PCx mRNA (AAV-shPCx) লক্ষ্য কৰি AAV-shRNA (short hairpin RNA) এনকোডিং mCherry সৃষ্টি কৰিলোঁ, আৰু ভাইৰাছ বা ইয়াৰ স্ক্ৰেম্বল্ড নিয়ন্ত্ৰণ (AAV-scr) Mfn2cKO এন্দুৰৰ মস্তিষ্কৰ বেজীত ইনজেকচন কৰিলোঁ। বয়সৰ চতুৰ্থ সপ্তাহত (চিত্ৰ ৫A) বেজী দিয়া হৈছিল যাতে পিচিএক্সৰ প্ৰকাশ বৃদ্ধি হোৱা সময়ছোৱাত (চিত্ৰ ৩চি) আৰু পিএন কোষৰ স্তৰটো এতিয়াও অক্ষত অৱস্থাত থকা সময়ছোৱাত (চিত্ৰ ১এ) ফলপ্ৰসূ পিচিএক্স নকডাউন লাভ কৰা হৈছিল। মন কৰিবলগীয়া যে পিচিএক্স (চিত্ৰ S8A) নমাই দিলে পিএন মৃত্যুৰ যথেষ্ট ত্বৰান্বিত হয়, যিটো সংক্ৰমিত আঙঠিত সীমাবদ্ধ থাকে (চিত্ৰ ৫, বি আৰু চি)। PCx আপ-ৰেগুলেচনৰ দ্বাৰা প্ৰৰোচিত বিপাকীয় প্ৰভাৱৰ ব্যৱস্থা বুজিবলৈ আমি PCx নকডাউন আৰু AAV-মধ্যস্থতাকাৰী অপটিকেল বায়'চেন্সৰ Grx1-roGFP2 একেলগে প্ৰকাশ কৰা হৈছিল (চিত্ৰ S8, B to D) গ্লুটাথিয়ন পেপটাইড redox সম্ভাৱনাৰ আপেক্ষিক পৰিৱৰ্তন (38)ৰ পিছত PNs redox অৱস্থা অধ্যয়ন. তাৰ পিছত, আমি FLIM অৱস্থা পৰীক্ষা কৰাৰ পিছত চাইট'প্লাজমিক ৰেডক্স অৱস্থাৰ সম্ভাৱ্য পৰিৱৰ্তন ধৰা পেলাবলৈ 7 সপ্তাহ পুৰণি Mfn2cKO বা নিয়ন্ত্ৰণ littermates তীব্ৰ মগজুৰ স্লাইচত দুটা-ফ'টন ফ্লু'ৰেচেন্স লাইফটাইম ইমেজিং মাইক্ৰস্কোপি (FLIM) সম্পন্ন কৰিলোঁ (চিত্ৰ S8, E to G)। বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে PCx প্ৰকাশৰ অভাৱত এটা Mfn2cKO PNs ৰ অক্সিডেচন অৱস্থা যথেষ্ট বৃদ্ধি পায়, যিটো নিয়ন্ত্ৰণ নিউৰন বা কেৱল scrambled shRNA প্ৰকাশ কৰা Mfn2cKO PNs ৰ পৰা পৃথক (চিত্ৰ ৫, D আৰু E)। যেতিয়া PCx এক্সপ্ৰেচন ডাউন-ৰেগুলেট কৰা হৈছিল, তেতিয়া অতি অক্সিডাইজড অৱস্থা দেখুওৱা Mfn2cKO PNs ৰ শতকৰা হাৰ তিনিগুণতকৈ অধিক বৃদ্ধি পায় (চিত্ৰ 5E), ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে PCx আপ-ৰেগুলেচনে অৱক্ষয়ী নিউৰনৰ ৰেডক্স ক্ষমতা বজাই ৰাখে।
(A) নিৰ্দিষ্ট বিপাকীয় পথ সক্ৰিয় হ’লে shPCx এনকোডিং কৰা AAV বেজী দিয়াৰ পৰীক্ষামূলক সময়সূচী দেখুওৱা এখন আঁচনি। (B) Mfn2cKO এন্দুৰৰ ৮ সপ্তাহ বয়সৰ চেৰিবেলাৰ অংশৰ প্ৰতিনিধিত্বমূলক কনফ’কেল ফটোগ্ৰাফ ৪ সপ্তাহত এণ্টি-কেলচিনিউৰিন এন্টিব’ডিৰে ট্ৰান্সডুচ আৰু লেবেল কৰা। স্কেল বাৰ, ৪৫০μm। (C) AAV-transduced লুপত Purkinje কোষ ঘনত্বৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় (ভেৰিয়েন্সৰ একমুখী বিশ্লেষণ; n = 3 ৰ পৰা 4 এন্দুৰ)। তথ্যসমূহ গড়±SEM হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়; ***পি<০.০০১। (D) প্ৰতিনিধি FLIM ছবিখনে নিৰ্দিষ্ট পৰীক্ষামূলক পৰিস্থিতিত গ্লুটাথাইয়ন ৰেডক্স চেন্সৰ Grx1-roGFP2 প্ৰকাশ কৰা ৭ সপ্তাহ পুৰণি পিএনৰ গড় আয়ুস দেখুৱাইছে। LUT (লুক-আপ টেবুল) অনুপাত: জীয়াই থকাৰ সময়ৰ ব্যৱধান (পিকোছেকেণ্ডত)। স্কেল বাৰ, ২৫μm। (E) হিষ্টোগ্ৰামত (D)ৰ পৰা Grx1-roGFP2 জীৱনকালৰ মানৰ বিতৰণ দেখুওৱা হৈছে (প্ৰতিটো অৱস্থাত দুটা এন্দুৰত n=158ৰ পৰা 368 কোষলৈ)। প্ৰতিটো হিষ্টোগ্ৰামৰ ওপৰৰ পাই চাৰ্টটোৱে: যথেষ্ট দীঘলীয়া (ৰঙা, অক্সিডাইজড) বা কম (নীলা, হ্ৰাস কৰা) আয়ুস মানৰ কোষৰ সংখ্যা দেখুৱাইছে, যি CTRL-AAV-scr ত গড় আয়ুস মানৰ ১ SD অতিক্ৰম কৰে। (F) প্ৰস্তাৱিত আৰ্হিটোৱে স্নায়ুকোষীয় পিচিএক্সৰ উৰ্ধ নিয়ন্ত্ৰণৰ সুৰক্ষামূলক প্ৰভাৱ দেখুৱাইছে।
মুঠতে আমি ইয়াত দিয়া তথ্যই দেখুৱাইছে যে MFN2 ৰ পুনৰ প্ৰকাশে গুৰুতৰ OXPHOS অভাৱ, গুৰুতৰ mtDNA হ্ৰাস, আৰু অতি অস্বাভাৱিক ista-ৰ দৰে আকৃতিৰ সৈতে উন্নত PN সম্পূৰ্ণৰূপে উদ্ধাৰ কৰিব পাৰে, যাৰ ফলত উন্নত ৰোগতো নিৰন্তৰ অগ্ৰগতি প্ৰদান কৰা হয়। স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ে কোষৰ মৃত্যুৰ আগৰ পৰ্যায়ৰ উলটিব পৰা প্ৰমাণ দিয়ে। এই মাত্ৰাৰ বিপাকীয় নমনীয়তাক নিউৰনে এথেৰ'স্কলেৰ'ছিছ (টিচিএ চক্ৰৰ এটা তাঁৰ সংযোগ) প্ৰৰোচিত কৰাৰ ক্ষমতাই আৰু অধিক গুৰুত্ব দিয়ে, যিয়ে OXPHOS নথকা পিএনসমূহত PCx প্ৰকাশক বাধা দিয়ে আৰু কোষৰ মৃত্যু বৃদ্ধি কৰে, যাৰ ফলত সুৰক্ষামূলক ভূমিকা পালন কৰে (চিত্ৰ ৫F)।
এই অধ্যয়নত আমি প্ৰমাণ দিলোঁ যে OXPHOS অকাৰ্য্যকৰীতাৰ প্ৰতি পিএনসমূহৰ প্ৰতিক্ৰিয়া হৈছে বিপাকীয় কাৰ্যসূচীৰ দ্বাৰা সক্ৰিয় কৰা ভিন্নতামূলক সক্ৰিয়কৰণ পথৰ জৰিয়তে ক্ৰমান্বয়ে TCA চক্ৰৰ এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছলৈ অভিসৰণ হোৱা। আমি বহুতো পৰিপূৰক পদ্ধতিৰে প্ৰটিঅ’মিক বিশ্লেষণ নিশ্চিত কৰিলোঁ আৰু প্ৰকাশ কৰিলোঁ যে যেতিয়া গুৰুতৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ দ্বাৰা প্ৰত্যাহ্বান জনোৱা হয়, তেতিয়া নিউৰনৰ বিপাকীয় স্থিতিস্থাপকতাৰ পূৰ্বতে অজ্ঞাত ৰূপ থাকে। আমাৰ আচৰিত কথাটো হ’ল যে সমগ্ৰ তাঁৰ সংযোগ প্ৰক্ৰিয়াই ক্ৰমান্বয়ে আৰু অপ্ৰত্যাৱৰ্তনীয়ভাৱে স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ৰ লগত অহা টাৰ্মিনেল বিপাকীয় অৱস্থাটো চিহ্নিত কৰাটো বাধ্যতামূলক নহয়, কিন্তু আমাৰ তথ্যই প্ৰকাশ কৰে যে ই কোষৰ মৃত্যুৰ আগৰ পৰ্যায়তো এটা ৰক্ষণাবেক্ষণ নিউৰন গঠন কৰিব পাৰে কাৰ্য্যকৰী ক্ষতিপূৰণ ব্যৱস্থা। এই তথ্যই ইংগিত দিয়ে যে নিউৰনত শৰীৰত বিপাকীয় প্লাষ্টিচিটি যথেষ্ট পৰিমাণে থাকে। এই তথ্যই প্ৰমাণ কৰে যে পিছলৈ এম এফ এন ২ৰ পুনৰ প্ৰৱৰ্তনে মূল বিপাকীয় চিহ্নিতকাৰীৰ প্ৰকাশ উলটিব পাৰে আৰু পি এন অৱক্ষয় ৰোধ কৰিব পাৰে। ইয়াৰ বিপৰীতে ই এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছক বাধা দিয়ে আৰু স্নায়ু ত্বৰান্বিত কৰে। ট্ৰেন্সচেক্সুৱেল।
আমাৰ গৱেষণাৰ এটা আকৰ্ষণীয় তথ্য হ’ল যে OXPHOS ৰ অভাৱত থকা পিএন সমূহে বিশেষভাৱে ধমনী স্ক্লেৰ’ছিছক উদ্দীপিত কৰা এনজাইমসমূহক আপ-ৰেগুলেট কৰি TCA চক্ৰৰ বিপাকীয় ক্ৰিয়াক পৰিৱৰ্তন কৰিব পাৰে। বিপাকীয় পুনৰ্বিন্যাস কেন্সাৰ কোষৰ এটা সাধাৰণ বৈশিষ্ট্য, ইয়াৰে কিছুমানে হ্ৰাসকাৰী সমতুল্য উৎপাদন কৰিবলৈ টিচিএ চক্ৰৰ মধ্যৱৰ্তী পদাৰ্থৰ পৰিপূৰক হিচাপে গ্লুটামাইনৰ ওপৰত নিৰ্ভৰ কৰে, যিয়ে শ্বাস-প্ৰশ্বাসৰ শৃংখলক পৰিচালিত কৰে আৰু লিপিড আৰু নিউক্লিঅ'টাইড জৈৱসংশ্লেষণ পূৰ্বসূৰীৰ উৎপাদন বজাই ৰাখে (39, 40)। শেহতীয়াকৈ কৰা এক অধ্যয়নে দেখুৱাইছে যে OXPHOS ৰ বিসংগতিৰ সন্মুখীন হোৱা পেৰিফেৰেল কলাত গ্লুটামাইন/গ্লুটামেট বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ পুনৰ সংযোগো এটা বিশিষ্ট বৈশিষ্ট্য (5, 41), য'ত TCA চক্ৰত গ্লুটামাইনৰ প্ৰৱেশৰ দিশ নিৰ্ভৰ কৰে Because of the graverity of OXPHOS injury (41)। ). কিন্তু শৰীৰত স্নায়ুকোষীয় বিপাকীয় প্লাষ্টিচিটিৰ কোনো সাদৃশ্য আৰু ৰোগৰ প্ৰসংগত ইয়াৰ সম্ভাৱ্য প্ৰাসংগিকতাৰ বিষয়ে স্পষ্ট প্ৰমাণৰ অভাৱ। শেহতীয়াকৈ ইন ভিট্ৰ' অধ্যয়নত প্ৰাথমিক কৰ্টিকেল নিউৰনে স্নায়ুসংবহনৰ বাবে গ্লুটামেট পুল সংগঠিত কৰা দেখা গৈছে, যাৰ ফলত বিপাকীয় চাপৰ অৱস্থাত অক্সিডেটিভ বিপাকীয় ক্ৰিয়া আৰু এথেৰ'স্কলেৰ'ছিছক প্ৰসাৰিত কৰে (৪২)। মন কৰিবলগীয়া যে টিচিএ চক্ৰ এনজাইম ছাক্সিনেট ডিহাইড্ৰ’জেনেজৰ ঔষধবিজ্ঞানসন্মত নিষেধৰ অধীনত পাইৰুভেট কাৰ্বক্সিলেচনে কালচাৰ কৰা চেৰিবেলাৰ গ্ৰেনুল নিউৰনত অক্সালোএচিটেটৰ সংশ্লেষণ বজাই ৰাখে বুলি বিশ্বাস কৰা হয় (৩৪)। কিন্তু মগজুৰ কলাৰ প্ৰতি এই ব্যৱস্থাসমূহৰ শাৰীৰিক প্ৰাসংগিকতা (য’ত এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছ মূলতঃ এষ্ট্ৰ’চাইটৰ মাজতে সীমাবদ্ধ বুলি বিশ্বাস কৰা হয়) এতিয়াও গুৰুত্বপূৰ্ণ শাৰীৰিক তাৎপৰ্য্য আছে (৪৩)। এই ক্ষেত্ৰত আমাৰ তথ্যই দেখুৱাইছে যে শৰীৰত অক্সফ’এছৰ দ্বাৰা ক্ষতিগ্ৰস্ত পিএনসমূহক বিচিএএ অৱক্ষয় আৰু পাইৰুভেট কাৰ্বক্সিলেচনলৈ সলনি কৰিব পাৰি, যিবোৰ টিচিএ পুল মধ্যৱৰ্তী পদাৰ্থৰ পৰিপূৰক হিচাপে লোৱা দুটা মূল উৎস। যদিও স্নায়ুকোষীয় শক্তি বিপাকীয় ক্ৰিয়াত বিচিএএ কেটাবলিজমৰ কল্পিত অৱদান প্ৰস্তাৱ কৰা হৈছে, স্নায়ুসংবহনৰ বাবে গ্লুটামেট আৰু জিএবিএৰ ভূমিকাৰ উপৰিও (৪৪), এতিয়াও ইন ভিভ'ত এই ব্যৱস্থাসমূহৰ কোনো প্ৰমাণ পোৱা নাই। গতিকে অনুমান কৰাটো সহজ যে অকাৰ্যকৰী পিএনসমূহে এথেৰ’স্কলেৰ’ছিছ বৃদ্ধি কৰি আত্মসাৎ প্ৰক্ৰিয়াৰ দ্বাৰা পৰিচালিত টিচিএ মধ্যৱৰ্তী পদাৰ্থৰ ব্যৱহাৰৰ ক্ষতিপূৰণ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে কৰিব পাৰে। বিশেষকৈ, এছপাৰটিক এচিডৰ চাহিদা বৃদ্ধি বজাই ৰাখিবলৈ পিচিএক্সৰ উৰ্ধ নিয়ন্ত্ৰণৰ প্ৰয়োজন হ'ব পাৰে, যিটো মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ সৈতে বৃদ্ধি পোৱা কোষত প্ৰস্তাৱ কৰা হয় (৪৫)। তথাপিও আমাৰ মেটাব'ল'মিক্স বিশ্লেষণে Mfn2cKO PNs (চিত্ৰ S6A) ত এছপাৰটিক এচিডৰ স্থিৰ অৱস্থাৰ মাত্ৰাত কোনো উল্লেখযোগ্য পৰিৱৰ্তন প্ৰকাশ কৰা নাছিল, যিয়ে অনুমানিকভাৱে প্ৰলিফেৰেটিং কোষ আৰু পোষ্ট-মাইটটিক নিউৰনৰ মাজত এছপাৰটিক এচিডৰ বিভিন্ন বিপাকীয় ব্যৱহাৰ প্ৰতিফলিত কৰে। যদিও ইন ভিভ'ত অকাৰ্য্যকৰী নিউৰনত পিচিএক্স উৰ্ধ নিয়ন্ত্ৰণৰ সঠিক ব্যৱস্থাৰ বৈশিষ্ট্য নিৰ্ণয় কৰা বাকী আছে, আমি প্ৰমাণ কৰিলোঁ যে এই অকাল সঁহাৰিয়ে নিউৰনৰ ৰেডক্স অৱস্থা বজাই ৰখাত গুৰুত্বপূৰ্ণ ভূমিকা পালন কৰে, যিটো চেৰিবেলাৰ স্লাইচৰ ওপৰত এফএলআইএম পৰীক্ষাত প্ৰদৰ্শিত হৈছিল। বিশেষকৈ পিএনসমূহে পিচিএক্সক আপ-ৰেগুলেট কৰাত বাধা দিলে অধিক অক্সিডাইজড অৱস্থাৰ সৃষ্টি হ’ব পাৰে আৰু কোষৰ মৃত্যু ত্বৰান্বিত হ’ব পাৰে। BCAA অৱক্ষয় সক্ৰিয়কৰণ আৰু পাইৰুভেটৰ কাৰ্বক্সিলেচন মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ পেৰিফেৰেল কলাৰ বৈশিষ্ট্য নিৰ্ণয় কৰাৰ উপায় নহয় (7)। গতিকে ইয়াক OXPHOS-অভাৱী নিউৰনৰ এটা অগ্ৰাধিকাৰ বৈশিষ্ট্য যেন লাগে, যদিও একমাত্ৰ বৈশিষ্ট্য নহয়, যিটো স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ৰ বাবে গুৰুত্বপূৰ্ণ। .
চেৰিবেলাৰ ৰোগ হৈছে এক বৈষম্যপূৰ্ণ ধৰণৰ স্নায়ুৰ অৱক্ষয়ী ৰোগ যি সাধাৰণতে এটাক্সিয়া হিচাপে প্ৰকাশ পায় আৰু প্ৰায়ে পিএনসমূহৰ ক্ষতি কৰে (৪৬)। এই নিউৰন জনসংখ্যা মাইট'কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ বাবে বিশেষভাৱে দুৰ্বল কাৰণ এন্দুৰত ইহঁতৰ নিৰ্বাচিত অৱক্ষয় মানৱ স্পাইনোচেৰিবেলাৰ এটাক্সিয়াৰ বৈশিষ্ট্যপূৰ্ণ বহুতো মটৰ লক্ষণ পুনৰুত্পাদন কৰিবলৈ যথেষ্ট (16, 47, 48)। প্ৰতিবেদন অনুসৰি, মিউটেণ্ট জিন থকা ট্ৰেন্সজেনিক মাউছ মডেল মানৱ স্পাইনোচেৰিবেলাৰ এটেক্সিয়াৰ সৈতে জড়িত আৰু ইয়াৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ডিছফংচন থাকে (৪৯, ৫০), যিয়ে পিএনপিএইচত অক্সফ’এছৰ অভাৱৰ পৰিণতি অধ্যয়নৰ গুৰুত্বৰ ওপৰত গুৰুত্ব আৰোপ কৰে। গতিকে এই অনন্য নিউৰন জনসংখ্যাক ফলপ্ৰসূভাৱে পৃথক কৰি অধ্যয়ন কৰাটো বিশেষভাৱে উপযোগী। কিন্তু পিএনসমূহ চাপৰ প্ৰতি অতি সংবেদনশীল আৰু সমগ্ৰ মস্তিষ্কৰ কোষৰ জনসংখ্যাৰ কম অংশ গ্ৰহণ কৰা বুলি ধৰি ল’লে, বহুতো অমিক্স ভিত্তিক অধ্যয়নৰ বাবে, গোটা কোষ হিচাপে ইহঁতক নিৰ্বাচিতভাৱে পৃথক কৰাটো এতিয়াও এটা প্ৰত্যাহ্বানমূলক দিশ। যদিও অন্য কোষ প্ৰকাৰৰ (বিশেষকৈ প্ৰাপ্তবয়স্ক কলা) দূষণৰ নিৰপেক্ষ অভাৱ লাভ কৰাটো প্ৰায় অসম্ভৱ, আমি FACS ৰ সৈতে এটা ফলপ্ৰসূ বিচ্ছেদ পদক্ষেপ সংযুক্ত কৰি ডাউনষ্ট্ৰিম প্ৰটিঅ'মিক্স বিশ্লেষণৰ বাবে পৰ্যাপ্ত সংখ্যক কাৰ্য্যক্ষম নিউৰন লাভ কৰিলোঁ, আৰু গোটেই মস্তিষ্কৰ বিদ্যমান তথ্যৰ গোটৰ তুলনাত যথেষ্ট উচ্চ প্ৰটিন কভাৰেজ (প্ৰায় ৩০০০ প্ৰটিন) আছে (৫১)। গোটেই কোষৰ জীৱন ধাৰণ ক্ষমতা সংৰক্ষণ কৰি আমি ইয়াত প্ৰদান কৰা পদ্ধতিটোৱে আমাক মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিপাকীয় পথৰ পৰিৱৰ্তন পৰীক্ষা কৰাই নহয়, ইয়াৰ চাইট’প্লাজমিক সমকক্ষসমূহৰ পৰিৱৰ্তন পৰীক্ষা কৰিবলৈও অনুমতি দিয়ে, যিয়ে কোষৰ প্ৰকাৰ সমৃদ্ধ কৰিবলৈ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল মেমব্ৰেন টেগৰ ব্যৱহাৰৰ পৰিপূৰক জটিল কলাত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ সংখ্যাৰ বাবে নতুন পদ্ধতি (৫২, ৫৩)। আমি বৰ্ণনা কৰা পদ্ধতিটো কেৱল পুৰকিঞ্জে কোষৰ অধ্যয়নৰ সৈতে জড়িত নহয়, মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ অন্যান্য মডেলকে ধৰি ৰোগীয়া মগজুৰ বিপাকীয় পৰিৱৰ্তনৰ সৈতে মোকাবিলা কৰিবলৈ যিকোনো ধৰণৰ কোষত সহজেই প্ৰয়োগ কৰিব পাৰি।
শেষত আমি এই বিপাকীয় পুনৰ্বিন্যাস প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত এনে এখন চিকিৎসামূলক খিৰিকী চিনাক্ত কৰিছো যিয়ে কোষীয় চাপৰ মূল লক্ষণসমূহ সম্পূৰ্ণৰূপে ওলোটা কৰিব পাৰে আৰু স্নায়ুকোষৰ অৱক্ষয় ৰোধ কৰিব পাৰে। গতিকে ইয়াত বৰ্ণনা কৰা তাঁৰ সংযোগৰ কাৰ্য্যকৰী প্ৰভাৱ বুজিলে মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ বিসংগতিৰ সময়ত স্নায়ুকোষীয় জীৱন ধাৰণ ক্ষমতা বজাই ৰখাৰ সম্ভাৱ্য চিকিৎসাৰ বিষয়ে মৌলিক অন্তৰ্দৃষ্টি লাভ কৰিব পাৰি। এই নীতিৰ অন্যান্য স্নায়ুজনিত ৰোগৰ ক্ষেত্ৰত প্ৰযোজ্যতা সম্পূৰ্ণৰূপে উন্মোচন কৰিবলৈ অন্যান্য মগজুৰ কোষ প্ৰকাৰৰ শক্তি বিপাকীয় ক্ৰিয়াৰ পৰিৱৰ্তন বিভাজিত কৰাৰ লক্ষ্যৰে ভৱিষ্যতৰ গৱেষণাৰ প্ৰয়োজন।
মাইট’পাৰ্ক এন্দুৰৰ বিষয়ে পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা হৈছে (৩১)। loxP flanking Mfn2 জিন থকা C57BL/6N এন্দুৰক পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা হৈছে (18) আৰু L7-Cre এন্দুৰৰ সৈতে সংকৰণ কৰা হৈছে (23)। তাৰ পিছত ডাবল হেটেৰ'জাইগাছ বংশধৰক সমযোজী Mfn2loxP/Mfn2loxP এন্দুৰৰ সৈতে সংকৰণ কৰি Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre)ৰ বাবে Purkinje-নিৰ্দিষ্ট জিন নকআউট সৃষ্টি কৰা হয়। সংগমৰ এটা উপগোটত, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP এলিল (stop-mtYFP) অতিৰিক্ত ক্ৰছিঙৰ জৰিয়তে প্ৰৱৰ্তন কৰা হৈছিল (20)। ইউৰোপীয়, ৰাষ্ট্ৰীয় আৰু প্ৰতিষ্ঠানিক নিৰ্দেশনা অনুসৰি সকলো পশুৰ পদ্ধতি সম্পন্ন কৰা হৈছিল আৰু জাৰ্মানীৰ উত্তৰ ৰাইন-ৱেষ্টফেলিয়াৰ উমৱেল্ট আৰু ভাৰব্ৰাউচাৰশ্বুটজৰ লেণ্ডেছামটফুৰনেচাৰে অনুমোদন জনাইছিল। পশুৰ কামো ইউৰোপীয় ফেডাৰেচন অৱ লেবৰেটৰী এনিমেল ছায়েন্স এছ’চিয়েশ্যনৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰণ কৰে।
গৰ্ভৱতী মহিলাৰ ছাৰ্ভাইকেল ডিচলকেচনক অজ্ঞান কৰি দিয়াৰ পিছত নিগনিৰ ভ্ৰূণ পৃথক কৰা হয় (E13)। 10 মিলিমিটাৰ হেপেছৰ পৰিপূৰক হিচাপে হেংকছৰ বেলেন্সড ছল্ট ছলিউচন (HBSS)ত কৰ্টেক্স বিভাজিত কৰি পেপেইন (20 U/ml) আৰু চিষ্টাইন (1μg/ml) যুক্ত ডালবেকোৰ মডিফাইড ঈগলছ মিডিয়ামত প্ৰেৰণ কৰা হৈছিল। কলাটো ডি এম ই এমত ইনকিউবেট কৰক) আৰু এনজাইমেটিক পাচনৰ দ্বাৰা বিচ্ছিন্ন কৰক। Ml) ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২০ মিনিটৰ বাবে, আৰু তাৰ পিছত ১০% ভ্ৰুণৰ গৰুৰ ছিৰামৰ সৈতে পৰিপূৰক ডি এম ই এমত যান্ত্ৰিকভাৱে মিল কৰা হয়। ইমেজিং বিশ্লেষণৰ বাবে প্ৰতি ৬ চে.মি. কালচাৰ ডিচত ২×১০৬ ঘনত্বত বা ০.৫×১০৫ কোষ/চে.মি. ৪ ঘণ্টাৰ পিছত মাধ্যমটোৰ ঠাইত ১% বি২৭ পৰিপূৰক আৰু ০.৫ মিলিমিটাৰ গ্লুটামেক্স যুক্ত নিউৰ’বেচেল ছিৰামমুক্ত মাধ্যম ব্যৱহাৰ কৰা হ’ল। তাৰ পিছত গোটেই পৰীক্ষাটোত নিউৰনবোৰক ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ আৰু ৫% CO2 ত ৰখা হৈছিল, আৰু সপ্তাহত এবাৰ খুৱাই দিয়া হৈছিল। ইন ভিট্ৰ’ত পুনঃসংমিশ্ৰণ প্ৰৰোচিত কৰিবলৈ, ইন ভিট্ৰ’ত দ্বিতীয় দিনটোত নিউৰনৰ চিকিৎসাৰ বাবে তলত দিয়া AAV9 ভাইৰাছ ভেক্টৰৰ ৩μl (২৪-ৱেল কালচাৰ ডিচ) বা ০.৫μl (২৪-ৱেল প্লেট) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল: AAV9.CMV.PI.eGFP। WPRE.bGH (এডজিন, কেটেলগ নম্বৰ 105530-AAV9) আৰু AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (এডজিন, কেটেলগ নম্বৰ 105545-AAV9)।
মাউছৰ Mfn1 আৰু Mfn2 পৰিপূৰক ডি এন এ (ক্ৰমে Addgene প্লাজমিড #23212 আৰু #23213 ৰ পৰা পোৱা) C-টাৰ্মিনাছত V5 ক্ৰমৰ সৈতে (GKPIPNPLLGLDST) চিহ্নিত কৰা হয়, আৰু T2A ক্ৰমৰ জৰিয়তে ফ্ৰেমত mCherry ৰ সৈতে সংযুক্ত কৰা হয়। Grx1-roGFP2 হাইডেলবাৰ্গ টিপি ডিক DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) ৰ পৰা উপহাৰ। প্ৰচলিত ক্ল'নিং পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰি tdTomato কেছেট সলনি কৰি, কেছেটটোক pAAV-CAG-FLEX-tdTomato মেৰুদণ্ডত (Addgene ৰেফাৰেন্স নম্বৰ ২৮৩০৬) চাবক্ল'ন কৰি pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 আৰু... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ভেক্টৰ। নিয়ন্ত্ৰণ ভেক্টৰ pAAV-CAG-FLEX-mCherry সৃষ্টি কৰিবলৈও একেধৰণৰ কৌশল ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। AAV-shPCx কনষ্ট্ৰাক্ট সৃষ্টি কৰিবলৈ এটা প্লাজমিড AAV ভেক্টৰ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1])ৰ প্ৰয়োজন হয়, য'ত মাউছ PCx (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCTCACCTTAGAGCGAAAG) লক্ষ্য কৰি shRNA এনকোড কৰা DNA ক্ৰম থাকে ৩′) U6 প্ৰ’ম’টাৰৰ নিয়ন্ত্ৰণত CMV প্ৰ’ম’টাৰৰ নিয়ন্ত্ৰণত mCherry ব্যৱহাৰ কৰা হয়। সহায়ক এ এ ভি ভেক্টৰৰ উৎপাদন প্ৰস্তুতকাৰকৰ নিৰ্দেশনা অনুসৰি (চেল বায়’লেবছ) কৰা হৈছিল। মুঠতে, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ক্ষণস্থায়ীভাৱে 293AAV কোষৰ সংক্ৰমণ-T2A-MFN1-V5), mCherry বহন কৰা এটা স্থানান্তৰ প্লাজমিড ব্যৱহাৰ কৰক (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) বা Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ক'ডিং জিন, লগতে ক'ডিং AAV1 কেপচিড প্ৰ'টিন আৰু আনুষংগিক প্ৰ'টিন পেকেজিং প্লাজমিড প্লাজমিড, কেলচিয়াম ফছফেট পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰি। খাৰুৱা ভাইৰাছৰ চুপাৰনেটেণ্ট শুকান বৰফ/ইথানল বাথত ফ্ৰীজ-থাউ চক্ৰ আৰু ফছফেট বাফাৰড চেলাইন (পিবিএছ)ত লাইজ কৰা কোষৰ দ্বাৰা পোৱা গৈছিল। এ এ ভি ভেক্টৰটোক বিচ্ছিন্ন আয়’ডিক্সানল গ্ৰেডিয়েণ্ট আল্ট্ৰাচেণ্ট্ৰিফিউগেচনৰ দ্বাৰা (৩২,০০০ আৰ পি এম আৰু ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২৪ ঘণ্টা) বিশুদ্ধ কৰা হৈছিল আৰু এমিকন আল্ট্ৰা-১৫ কেন্দ্ৰপৃথক ফিল্টাৰ ব্যৱহাৰ কৰি ঘনীভূত কৰা হৈছিল। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 জিনম কপি (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX ৰ জিনম টাইটাৰ পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা ধৰণে আছিল (54), বাস্তৱ সময়ৰ পৰিমাণগত PCR (qPCR) দ্বাৰা জুখিছিল। -MFN1-V5 (১.৯×১০১৩ GC/মিলিলিটাৰ) আৰু AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (৮.৯×১০১২ জিচি/মিলিলিটাৰ)।
প্ৰাথমিক নিউৰনসমূহক বৰফৰ দৰে ঠাণ্ডা 1x PBS ত স্ক্ৰেপ কৰি পেলেট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ফছফেটেজ আৰু প্ৰটিজ ইনহিবিটাৰ (Roche) যুক্ত 0.5% ট্ৰাইটন এক্স-100 / 0.5% ছডিয়াম ডিঅক্সিক'লেট/PBS লাইছিছ বাফাৰত সমতা কৰা হৈছিল। বাইচিনকোনিনিক এচিড পৰীক্ষা (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ব্যৱহাৰ কৰি প্ৰটিনৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল। তাৰ পিছত প্ৰটিনবোৰক এছডিএছ-পলিএক্ৰিলামাইড জেল ইলেক্ট্ৰ’ফ’ৰেচিছৰ দ্বাৰা পৃথক কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত পলিভিনাইলডিন ফ্ল’ৰাইড মেমব্ৰেন (জিই হেল্থকেয়াৰ)ত ব্লট কৰা হৈছিল। অ-নিৰ্দিষ্ট স্থানসমূহ ব্লক কৰক আৰু টিবিএছটি (টুইনৰ সৈতে ট্ৰাইছ-বাফাৰড চেলাইন)ত ৫% গাখীৰত প্ৰাথমিক এন্টিব’ডিৰ সৈতে (বিৱৰণৰ বাবে সূচী S1 চাওক) ইনকিউবেট কৰক, ধোৱাৰ পদক্ষেপ আৰু টিবিএছটি ইনকিউবেটত গৌণ এন্টিব’ডি। প্ৰাথমিক এন্টিব’ডিৰ সৈতে +৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰক। ধোৱাৰ পিছত ছেকেণ্ডাৰী এন্টিব’ডি ২ ঘণ্টা কোঠাৰ উষ্ণতাত প্ৰয়োগ কৰিব লাগে। তাৰ পিছত একেটা ব্লটক এণ্টি-β-এক্টিন এণ্টিব’ডিৰ সৈতে ইনকিউবেট কৰি একেটা লোডিং নিশ্চিত কৰা হয়। কেমিলুমিনেচেন্সলৈ ৰূপান্তৰিত কৰি ধৰা পেলোৱা আৰু কেমিলুমিনেচেন্স বৃদ্ধি কৰি (জি ই হেল্থকেয়াৰ)।
কাঁচৰ কভাৰস্লিপত পূৰ্বে বীজ সিঁচা নিউৰনবোৰক ৪% পেৰাফৰ্মেলডিহাইড (PFA)/PBS দ্বাৰা নিৰ্দিষ্ট সময়ত কোঠাৰ উষ্ণতাত ১০ মিনিটৰ বাবে স্থাপন কৰা হৈছিল। কভাৰস্লিপবোৰ প্ৰথমে কোঠাৰ উষ্ণতাত ৫ মিনিটৰ বাবে ০.১% ট্ৰাইটন এক্স-১০০/পিবিএছৰ সৈতে সোমাই দিয়া হয়, আৰু তাৰ পিছত ব্লক কৰা বাফাৰত [৩% ব'ভাইন ছিৰাম এলবুমিন (বিএছএ)/পিবিএছ]। দ্বিতীয় দিনা কভাৰস্লিপবোৰ ব্লক কৰা বাফাৰেৰে ধুই উপযুক্ত ফ্ল’ৰ’ফ’ৰ-কনজুগেটেড ছেকেণ্ডাৰী এন্টিব’ডিৰ সৈতে কোঠাৰ উষ্ণতাত ২ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰা হ’ল; তাৰ পিছত 4′,6-ডাইমিডিনো-2 -ফেনিলিণ্ডোল (DAPI) ৰ সৈতে PBS ত ভালদৰে ধুই পেলোৱা হয় আৰু তাৰ পিছত Aqua-Poly/Maunt ৰ সহায়ত মাইক্ৰস্কোপ স্লাইডত স্থাপন কৰা হয়।
এন্দুৰক (মতা আৰু মাইকী) কেটামাইন (১৩০ মিলিগ্ৰাম/কিলোগ্ৰাম) আৰু জাইলাজিন (১০ মিলিগ্ৰাম/কিলোগ্ৰাম)ৰ ইন্ট্ৰাপেৰিটনিয়াল বেজী দি অজ্ঞান কৰি কাৰ্প্ৰফেন বিষনাশক (৫ মিলিগ্ৰাম/কিলোগ্ৰাম) ছালৰ তলত প্ৰদান কৰা হৈছিল, আৰু গৰম পেডযুক্ত ষ্টেৰিঅ'টেকটিক যন্ত্ৰ (Kopf)ত ৰখা হৈছিল। মূৰৰ খুলিটো উন্মোচন কৰক আৰু ডেণ্টেল ড্ৰিল ব্যৱহাৰ কৰি মিছ হাড়ৰ সৈতে সংগতি ৰাখি চেৰিবেলাৰ কৰ্টেক্সৰ অংশটো পাতল কৰক (লেমবডাৰ পৰা: ঠেং ১.৮, পাৰ্শ্বীয় ১, লোবুল IV আৰু Vৰ সৈতে মিল থকা)। তলৰ ৰক্তবাহী নলীত ব্যাঘাত জন্মাব নোৱাৰাকৈ মূৰৰ খুলিত সৰু ফুটা এটা সাৱধানে সৃষ্টি কৰিবলৈ বক্ৰ চিৰিঞ্জ বেজী ব্যৱহাৰ কৰক। তাৰ পিছত পাতলকৈ টানি অনা কাঁচৰ কেপিলাৰীটো লাহে লাহে মাইক্ৰ’-হোলটোত (ডুৰা মেটাৰৰ ভেণ্ট্ৰেল ফালে -১.৩ৰ পৰা -১লৈ) সুমুৱাই দিয়া হয়, আৰু ১০ৰ পৰা ২০ মিনিটৰ খিৰিকীৰে কম চাপত কেইবাবাৰো মাইক্ৰ’-ইঞ্জেক্টৰ (নাৰিছিগে)ত ২০০ৰ পৰা ৩০০ এন এল এ এ ভি ইনজেকচন কৰা হয়। ইনফিউজনৰ পিছত কেপিলাৰীটো আৰু ১০ মিনিট ৰাখিব লাগে যাতে ভাইৰাছটো সম্পূৰ্ণৰূপে বিয়পিব পাৰে। কেপিলাৰীবোৰ উলিয়াই লোৱাৰ পিছত ছালখন সাৱধানে চিলাই কৰা হয় যাতে ঘাঁৰ প্ৰদাহ কম হয় আৰু জন্তুটো সুস্থ হ’ব পাৰে। অস্ত্ৰোপচাৰৰ পিছত কেইবাদিনো জীৱ-জন্তুবোৰক বিষনাশক (কেচপ’ফেন) দ্বাৰা চিকিৎসা কৰা হৈছিল, এই সময়ছোৱাত ইহঁতৰ শাৰীৰিক অৱস্থা সযতনে নিৰীক্ষণ কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত নিৰ্দিষ্ট সময়ত ইউথেনাইজ কৰা হৈছিল। ইউৰোপীয়, ৰাষ্ট্ৰীয় আৰু প্ৰতিষ্ঠানিক নিৰ্দেশনা অনুসৰি সকলো পদ্ধতি সম্পন্ন কৰা হৈছিল আৰু জাৰ্মানীৰ উত্তৰ ৰাইন-ৱেষ্টফেলিয়াৰ উমৱেল্ট আৰু ভাৰব্ৰাউচাৰশ্বুটজৰ লেণ্ডেছামটফুৰনেচাৰে অনুমোদন জনাইছিল।
জীৱ-জন্তুবোৰক কেটামাইন (১০০ মিলিগ্ৰাম/কিলোগ্ৰাম) আৰু জাইলাজিন (১০ মিলিগ্ৰাম/কিলোগ্ৰাম) দ্বাৰা অজ্ঞান কৰা হৈছিল, আৰু হৃদযন্ত্ৰত প্ৰথমে ০.১ এম পিবিএছ, আৰু তাৰ পিছত পিবিএছত ৪% পিএফএ পাৰ্ফিউজ কৰা হৈছিল। কলাটো বিভাজিত কৰি ৪% পিএফএ/পিবিএছত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাতিটোৰ বাবে স্থাপন কৰা হ’ল। পিবিএছত স্থিৰ মগজুৰ পৰা চেজিটেল অংশ (৫০ মাইক্ৰ’মিটাৰ ডাঠ) প্ৰস্তুত কৰিবলৈ কম্পন কটাৰী (লেইকা মাইক্ৰ’চিষ্টেমছ জিএমবিএইচ, ভিয়েনা, অষ্ট্ৰিয়া) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। অন্যথা নিৰ্দিষ্ট নকৰালৈকে, মুক্তভাৱে ভাসমান অংশসমূহক ওপৰত বৰ্ণনা কৰা ধৰণে (১৩) কোঠাৰ উষ্ণতাত আৰু লৰচৰ কৰি ৰং কৰা হৈছিল। মুঠতে প্ৰথমে পোৱা স্লাইচবোৰক ০.৫% ট্ৰাইটন এক্স-১০০/পিবিএছৰ সৈতে কোঠাৰ উষ্ণতাত ১৫ মিনিটৰ বাবে পাৰ্যমান্য কৰি তোলা হৈছিল; কিছুমান এপিট'পৰ বাবে (Pcx আৰু Shmt2), 80°C (PH 9) ত tris-EDTA বাফাৰত এই পদক্ষেপৰ পৰিৱৰ্তে 25 মিনিটৰ বাবে স্লাইচবোৰ গৰম কৰক। ইয়াৰ পিছত, অংশবোৰক প্ৰাথমিক এন্টিব’ডিৰ সৈতে (তালিকা S1 চাওক) ব্লক কৰা বাফাৰত (3% BSA/PBS) ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত লৰচৰ কৰি ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। পিছদিনা অংশবোৰ ব্লক কৰা বাফাৰেৰে ধুই উপযুক্ত ফ্ল’ৰ’ফ’ৰ-কনজুগেটেড ছেকেণ্ডাৰী এন্টিব’ডিৰ সৈতে কোঠাৰ উষ্ণতাত ২ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰা হ’ল; শেষত, অংশবোৰ পিবিএছত ভালদৰে ধুই ডিএপিআইৰে কাউণ্টাৰ-ষ্টেইন কৰা হ'ল আৰু তাৰ পিছত একুৱাপলিমাউণ্টৰ সহায়ত মাইক্ৰস্কোপ স্লাইডত স্থাপন কৰা হ'ল।
নমুনাটোৰ ছবি তুলিবলৈ বগা পোহৰৰ লেজাৰ আৰু ৪০৫ ডাইঅ’ড অতিবেঙুনীয়া লেজাৰেৰে সজ্জিত লেজাৰ স্কেনিং কনফ’কেল মাইক্ৰস্কোপ (টিচিএছ এছপি৮-এক্স বা টিচিএছ ডিজিটেল লাইট শ্বীট, লেইকা মাইক্ৰ’চিষ্টেমছ) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ফ্ল'ৰ'ফ'ৰক উত্তেজিত কৰি আৰু হাইব্ৰিড ডিটেক্টৰ (HyDs) ৰ সহায়ত সংকেত সংগ্ৰহ কৰি, LAS-X চফ্টৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি ক্ৰমিক ধৰণত নাইকুইষ্ট নমুনা সংগ্ৰহৰ সৈতে মিল থকা ষ্টেক কৰা ছবি সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল: অ-পৰিমাণগত পেনেলৰ বাবে, ই অতি গতিশীল সংকেত (উদাহৰণস্বৰূপে, দেহগত কোষ আৰু ডেণ্ড্ৰাইটত) mtYFP) BrightR মোডত PN ৰ সংখ্যা ধৰা পেলাবলৈ HyD ব্যৱহাৰ কৰক)। পটভূমি হ্ৰাস কৰিবলৈ ০.৩ৰ পৰা ৬ ns লৈ গেটিং প্ৰয়োগ কৰা হয়।
সজাই তোলা কোষৰ বাস্তৱ সময়ৰ প্ৰতিচ্ছবি। 1% B27 পৰিপূৰক আৰু 0.5 mM GlutaMax যুক্ত Neurobasal-A মাধ্যমত সজাই পৰাই লোৱাৰ পিছত, কোষবোৰক তৎক্ষণাত পলি-l-লাইচিন-আৱৰণযুক্ত কাঁচৰ স্লাইডত (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalog number 80826) বীজ সিঁচি দিয়া হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ইয়াক 37°C আৰু 5% CO2 ত 1 ঘণ্টা ৰাখি কোষবোৰ থিতাপি ল'বলৈ দিয়া হৈছিল। ৰিয়েল-টাইম ইমেজিং লেইকা এছ পি ৮ লেজাৰ স্কেনিং কনফ’কেল মাইক্ৰস্কোপত কৰা হৈছিল যিটো বগা লেজাৰ, হাই ডি, ৬৩×[১.৪ নিউমেৰিকেল এপাৰচাৰ (এন এ)] অইল অবজেক্টিভ লেন্স আৰু হিটিং ষ্টেজৰ সৈতে সজ্জিত হৈছিল।
মাউছটোক কাৰ্বন ডাই অক্সাইডেৰে দ্ৰুতভাৱে অজ্ঞান কৰি মূৰ কাটি পেলোৱা হৈছিল, মগজুটো দ্ৰুতভাৱে মূৰৰ খুলিৰ পৰা আঁতৰাই পেলোৱা হৈছিল, আৰু ২০০মাইক্ৰ'মিটাৰ ডাঠ (১৩চি লেবেলিং পৰীক্ষাৰ বাবে) বা ২৭৫মাইক্ৰ'মিটাৰ ডাঠ (দুটা ফ'টন পৰীক্ষাৰ বাবে) চেজিটেল অংশত কাটি তলত দিয়া সামগ্ৰীৰে ভৰাই দিয়া হৈছিল আইচক্ৰীম (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) তলত দিয়া পদাৰ্থৰে ভৰোৱা হয়: ১২৫ মিলিমিটাৰ বৰফৰ দৰে ঠাণ্ডা, কাৰ্বন-সংপৃক্ত (৯৫% O2 আৰু ৫% CO2) কম Ca2 + কৃত্ৰিম চেৰিব্ৰ’স্পাইনেল ফ্লুইড (ACSF) NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম ফছফেট বাফাৰ, ২৫ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫ মিলিমিটাৰ গ্লুক’জ, ০.৫ মিলিমিটাৰ CaCl2 আৰু... ৩.৫ মিলিমিটাৰ MgCl2 (৩১০ৰ পৰা ৩৩০ মিলিমোল অস্মোটিক চাপ)। প্ৰাপ্ত মগজুৰ স্লাইচবোৰ অধিক Ca2 + ACSF (১২৫.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ d-গ্লুক’জ, ১.০ মিলিমিটাৰ CaCl2 আৰু ২.০ মিলিমিটাৰ MgCl2) যুক্ত প্ৰি-ইনকিউবেচন চেম্বাৰলৈ স্থানান্তৰিত কৰক। মধ্যম) pH ৭.৪ আৰু ৩১০ৰ পৰা ৩২০ মিলিমোল)।
ইমেজিং প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত স্লাইচবোৰক এটা নিৰ্দিষ্ট ইমেজিং কক্ষলৈ লৈ যোৱা হৈছিল, আৰু পৰীক্ষাটো ৩২°ৰ পৰা ৩৩ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছৰ স্থিৰ উষ্ণতাত অবিৰত এচিএছএফ পাৰ্ফিউচনৰ অধীনত কৰা হৈছিল। স্লাইচ ইমেজিঙৰ বাবে লেইকা ২৫এক্স অবজেক্টিভ লেন্স (এন এ ০.৯৫, পানী)ৰে সজ্জিত মাল্টিফ’টন লেজাৰ স্কেনিং মাইক্ৰস্কোপ (টিচিএছ এছপি৮ এমপি-অ’পিঅ’, লেইকা মাইক্ৰ’চিষ্টেমছ), টি: চেফায়াৰ লেজাৰ (চেমেলিয়ন ভিজন II, কোহেৰেণ্ট) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। FLIM মডিউল (PicoHarp300, PicoQuant)।
Grx1-roGFP2 ৰ FLIM। পিএনসমূহৰ চাইট’প্লাজমিক ৰেডক্স অৱস্থাৰ পৰিৱৰ্তন চেজিটেল মগজুৰ স্লাইচত দুটা ফ’টন এফএলআইএমৰ দ্বাৰা জুখিছিল, য’ত Grx1-roGFP2 বায়’চেন্সৰে পিএনসমূহক লক্ষ্য কৰি লৈছিল। পিএন স্তৰত, অধিগ্ৰহণ ক্ষেত্ৰখন স্লাইচৰ পৃষ্ঠৰ প্ৰায় ৫০ৰ পৰা ৮০ মাইক্ৰ'মিটাৰ তলত নিৰ্বাচন কৰা হয় যাতে এটা কাৰ্য্যক্ষম পিএন (অৰ্থাৎ ডেণ্ড্ৰাইটৰ কাষেৰে বিডযুক্ত গঠন বা নিউৰনেল মৰ্ফ'লজিকেল পৰিৱৰ্তনৰ অভাৱ) আৰু ডাবল পজিটিভ roGFP2 চেন্সৰ আৰু এএভি এনকোডিং shRNA PCx বা ইয়াৰ নিয়ন্ত্ৰণ ক্ৰম (প্ৰতিটোৱেই mCherry সহ-প্ৰকাশ) থাকে। 2x ডিজিটেল জুমৰ সৈতে একক-ষ্টেক ছবি সংগ্ৰহ কৰক [উত্তেজনা তৰংগদৈৰ্ঘ্য: 890 nm; ৫১২ এন এম ৫১২ পিক্সেল]। ধৰা পেলোৱা: আভ্যন্তৰীণ HyD, ফ্লু'ৰেচিন আইছ'থাইঅ'চাইনেট (FITC) ফিল্টাৰ গোট] আৰু ২ৰ পৰা ৩ মিনিটৰ ভিতৰত ছবিৰ গড় ব্যৱহাৰ কৰি বক্ৰ ফিটিঙৰ বাবে পৰ্যাপ্ত ফ'টন সংগ্ৰহ (মুঠ ১০০০ ফ'টন) হোৱাটো নিশ্চিত কৰা হয়। Grx1-roGFP2 প্ৰ'বৰ সংবেদনশীলতা আৰু FLIM অৱস্থাৰ পৰীক্ষণ পাৰ্ফিউচন ACSF ত বহিৰ্জাতীয় 10 mM H2O2 যোগ কৰাৰ সময়ত (অক্সিডেচন সৰ্বাধিক কৰিবলৈ, যাৰ ফলত আয়ুস বৃদ্ধি পায়), আৰু তাৰ পিছত 2 mM dithiothreitol যোগ কৰিলে (হ্ৰাস হোৱাৰ মাত্ৰা কম হয়, যাৰ ফলত হ্ৰাস পায়) roGFP2 ৰ আয়ুসকালৰ মান নিৰীক্ষণ কৰি কৰা হৈছিল জীৱনকালত) (চিত্ৰ S8, D ৰ পৰা G লৈ)। FLIMfit 5.1.1 চফট্ ৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি আহৰণ কৰা ফলাফল বিশ্লেষণ কৰক, সমগ্ৰ ছবিখনৰ একক ঘাতীয় ক্ষয় বক্ৰটো জুখি উলিওৱা IRF (যন্ত্ৰৰ প্ৰতিক্ৰিয়া ফলন)ৰ সৈতে ফিট কৰক, আৰু χ2 প্ৰায় ১।
মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ সম্ভাৱনা বিশ্লেষণ। তীব্ৰ অংশটোক পাৰ্ফিউজ কৰা এচিএছএফত পোনপটীয়াকৈ যোগ কৰা ১০০ এনএম টিএমআৰএমৰ সৈতে ৩০ মিনিটৰ বাবে ইনকিউবেট কৰাৰ পিছত পিএনসমূহৰ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল বিভৱৰ পৰিৱৰ্তন দুটা ফ’টন মাইক্ৰস্কোপৰ দ্বাৰা জুখিছিল। টিএমআৰএম ইমেজিং ৯২০ এনএমত প্ৰ'বক উত্তেজিত কৰি আৰু সংকেত সংগ্ৰহ কৰিবলৈ আভ্যন্তৰীণ হাইডি (টেট্ৰামিথাইলৰ'ডামাইন আইছ'থাইঅ'চাইনেট: ৫৮৫/৪০ এনএম) ব্যৱহাৰ কৰি সম্পন্ন কৰা হৈছিল; একেটা উত্তেজনা তৰংগদৈৰ্ঘ্য ব্যৱহাৰ কৰি কিন্তু mtYFP ছবিত এটা ভিন্ন আভ্যন্তৰীণ HyD (FITC :525/50) ব্যৱহাৰ কৰি। একক কোষ স্তৰত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ সম্ভাৱনা মূল্যায়ন কৰিবলৈ ImageJ ৰ ইমেজ কেলকুলেটৰ প্লাগ-ইন ব্যৱহাৰ কৰক। মুঠতে, প্লাগ-ইন সমীকৰণ: সংকেত = min (mtYFP, TMRM) ব্যৱহাৰ কৰা হয় মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল অঞ্চল চিনাক্ত কৰিবলৈ যিয়ে সংশ্লিষ্ট চেনেলৰ একক-ষ্টেক কনফ’কেল ছবিত পুৰকিঞ্জে ছোমালি ভাষাত টিএমআৰএম সংকেত দেখুৱায়। তাৰ পিছত ফলাফল মাস্কত থকা পিক্সেল এলেকাটো পৰিমাণীকৰণ কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত mtYFP চেনেলৰ সংশ্লিষ্ট থ্ৰেছহ'ল্ড একক-ষ্টেক ছবিত স্বাভাৱিক কৰি মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল বিভৱ দেখুওৱা মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল অংশটো পোৱা যায়।
ছবিখন হুইজেন্স প্ৰ’ (চায়ন্টিফিক ভলিউম ইমেজিং) চফট্ ৱেৰৰ সহায়ত ডিকনভল্যুট কৰা হৈছিল। টাইলছৰ স্কেন কৰা ছবিৰ বাবে এটা টাইলৰ মণ্টেজ LAS-X চফট্ ৱেৰে প্ৰদান কৰা স্বয়ংক্ৰিয় চিলাই এলগৰিদম ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হয়। ছবি মানাংকনৰ পিছত ছবিখন অধিক প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰিবলৈ আৰু উজ্জ্বলতা আৰু কনট্ৰাষ্ট একেদৰে সামঞ্জস্য কৰিবলৈ ImageJ আৰু Adobe Photoshop ব্যৱহাৰ কৰক। গ্ৰাফিক প্ৰস্তুতিৰ বাবে Adobe Illustrator ব্যৱহাৰ কৰক।
mtDNA ফোকাচ বিশ্লেষণ। কনফ’কেল মাইক্ৰস্কোপৰ দ্বাৰা ডি এন এৰ বিৰুদ্ধে এন্টিব’ডিৰে লেবেল কৰা চেৰিবেলাৰ অংশত mtDNA ক্ষতৰ সংখ্যা পৰিমাণীকৰণ কৰা হৈছিল। প্ৰতিটো লক্ষ্য এলেকা কোষৰ শৰীৰ আৰু প্ৰতিটো কোষৰ নিউক্লিয়াছৰ বাবে সৃষ্টি কৰা হৈছিল আৰু নিজ নিজ এলেকা মাল্টি মেজাৰ প্লাগ-ইন (ImageJ চফট্ ৱেৰ) ব্যৱহাৰ কৰি গণনা কৰা হৈছিল। কোষৰ শৰীৰৰ ক্ষেত্ৰফলৰ পৰা নিউক্লিয়াৰ এলেকা বিয়োগ কৰি চাইট’প্লাজমিক এলেকা পোৱা যায়। শেষত, বিশ্লেষণ কণা প্লাগ-ইন (ImageJ চফট্ ৱেৰ) ব্যৱহাৰ কৰি থ্ৰেছহ'ল্ড ছবিত mtDNA সূচক চাইট'প্লাজমিক ডি এন এ বিন্দুসমূহ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে পৰিমাণীকৰণ কৰা হৈছিল, আৰু পোৱা ফলাফলসমূহ চিটিআৰএল এন্দুৰৰ পিএন গড়লৈ স্বাভাৱিক কৰা হৈছিল। ফলাফলসমূহ প্ৰতিটো কোষৰ গড় নিউক্লিঅ’চাইডৰ সংখ্যা হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়।
প্ৰটিন প্ৰকাশ বিশ্লেষণ। একক কোষ স্তৰত পিএনত প্ৰটিন প্ৰকাশৰ মূল্যায়ন কৰিবলৈ ImageJ ৰ ইমেজ কেলকুলেটৰ প্লাগ-ইন ব্যৱহাৰ কৰক। মুঠতে, সংশ্লিষ্ট চ্যানেলৰ একক-স্তৰীয় কনফ’কেল ছবিত, সমীকৰণটোৰ জৰিয়তে: সংকেত = min (mtYFP, এন্টিব’ডি), পুৰকিনাত এটা নিৰ্দিষ্ট এন্টিব’ডিৰ প্ৰতি ইমিউন’ৰিয়েক্টিভিটি দেখুওৱা মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল অঞ্চলটো চিনাক্ত কৰা হয়। তাৰ পিছত ফলাফল মাস্কৰ পিক্সেল এলেকা পৰিমাণীকৰণ কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত mtYFP চেনেলৰ সংশ্লিষ্ট থ্ৰেছহ'ল্ড একক-ষ্টেক ছবিত স্বাভাৱিক কৰি প্ৰদৰ্শিত প্ৰ'টিনৰ মাইট'কণ্ড্ৰিয়াল অংশ লাভ কৰা হয়।
পুৰকিঞ্জে কোষৰ ঘনত্ব বিশ্লেষণ। ImageJ ৰ Cell Counter প্লাগ-ইন ব্যৱহাৰ কৰি গণনা কৰা Purkinje কোষৰ সংখ্যাক গণনা কৰা কোষবোৰে দখল কৰা মস্তিষ্কৰ আঙঠিৰ দৈৰ্ঘ্যৰে ভাগ কৰি Purkinje ঘনত্ব মূল্যায়ন কৰা হৈছিল।
নমুনা প্ৰস্তুত আৰু সংগ্ৰহ। নিয়ন্ত্ৰণ গোট আৰু Mfn2cKO এন্দুৰৰ মগজুক ০.১ এম ফছফেট বাফাৰ (PB)ত ২% PFA/২.৫% গ্লুটাৰএলডিহাইডত স্থাপন কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত চিলিয়াট (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (বেধ ৫০ৰ পৰা ৬০ μm) ব্যৱহাৰ কৰি ক’ৰ’নাল অংশ প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল ১.৫% পটাছিয়াম ফেৰ’চাইনাইড কোঠাৰ উষ্ণতাত ১ ঘণ্টা ৰাখিব লাগে। ডিষ্টিলড পানীৰে তিনিবাৰ ধুই তাৰ পিছত ১% ইউৰেনাইল এচিটেট যুক্ত ৭০% ইথানলে ২০ মিনিটৰ বাবে ৰং কৰা হ’ল। তাৰ পিছত অংশবোৰ গ্ৰেডেড এলকহলত পানীমুক্ত কৰি চিলিকন আৱৰণযুক্ত কাঁচৰ স্লাইডৰ মাজত ডাৰকুপান এচিএম (আৰালডাইট কাষ্টিং ৰেজিন এম) ইপক্সি ৰেজিনত (ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰস্কোপি চাইন্সেছ, কেটেলগ নম্বৰ ১৪০৪০) সোমাই দিয়া হয় আৰু শেষত ৬০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত অভেনত ৪৮ ঘণ্টা পলিমাৰাইজ কৰা হয়। চেৰিবেলাৰ কৰ্টেক্সৰ অংশ নিৰ্বাচন কৰি লেইকা আল্ট্ৰাকাট (লেইকা মাইক্ৰ’চিষ্টেম জিএমবিএইচ, ভিয়েনা, অষ্ট্ৰিয়া)ত ৫০ এনএম আল্ট্ৰাথিন অংশ কাটি পলিষ্টাইৰিন ফিল্মেৰে আৱৰণ দিয়া ২×১ মিলিমিটাৰ তামৰ স্লিট গ্ৰীডত ছিঙি লোৱা হৈছিল। অংশবোৰ H2O ত ৪% ইউৰেনাইল এচিটেটৰ দ্ৰৱণেৰে ১০ মিনিট ৰং কৰি H2O ৰে কেইবাবাৰো ধুই তাৰ পিছত H2O ত ৰেইনল্ডছ লিড চাইট্ৰেটেৰে ১০ মিনিট ধুই তাৰ পিছত H2O ৰে কেইবাবাৰো ধুই লোৱা হ’ল। টিভিআইপিএছ (টিয়েটজ ভিডিঅ’ এণ্ড ইমেজ প্ৰচেছিং চিষ্টেম) টেমকেম-এফ৪১৬ ডিজিটেল কেমেৰা (টিভিআইপিএছ জিএমবিএইচ, গ’টিং, আমেৰিকা) ব্যৱহাৰ কৰি ট্ৰেন্সমিছন ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰস্কোপ ফিলিপছ চিএম১০০ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ৱালথাম, এম এ, আমেৰিকা)ৰ সহায়ত মাইক্ৰ’গ্ৰাফ লোৱা হৈছিল। জাৰ্মানী)।
এ এ ভি সংক্ৰমিত এন্দুৰৰ বাবে মগজুটো পৃথক কৰি ১ মিলিমিটাৰ ডাঠ চেজিটেল অংশত কাটি লোৱা হৈছিল আৰু এ এ ভি সংক্ৰমিত আঙঠিটো (অৰ্থাৎ mCherry এক্সপ্ৰেছিং) চিনাক্ত কৰিবলৈ ফ্লু’ৰেচেন্স মাইক্ৰস্কোপ ব্যৱহাৰ কৰি চেৰিবেলাম পৰীক্ষা কৰা হৈছিল। কেৱল সেইবোৰ পৰীক্ষাহে ব্যৱহাৰ কৰা হয় য’ত এএভি বেজীৰ ফলত অন্ততঃ দুটা একেৰাহে মস্তিষ্কৰ আঙঠিত পাৰ্কিঞ্জে কোষ স্তৰৰ (অৰ্থাৎ প্ৰায় সমগ্ৰ স্তৰটো) অতি উচ্চ ট্ৰান্সডাকচন কাৰ্যক্ষমতা পোৱা যায়। AAV-ট্ৰেন্সডুচড লুপটোক ৰাতিটোৰ বাবে পোষ্ট-ফিক্সেচনৰ বাবে মাইক্ৰ’ডিচেক্ট কৰা হৈছিল (০.১ এম ক’ক’ট বাফাৰত ৪% পিএফএ আৰু ২.৫% গ্লুটাৰএলডিহাইড) আৰু অধিক প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰা হৈছিল। EPON এম্বেডিঙৰ বাবে, স্থিৰ কলাটো 0.1 M ছডিয়াম ক'ক'ট বাফাৰ (Applichem) দ্বাৰা ধুই দিয়া হৈছিল, আৰু 0.1 M ছডিয়াম কোকোট বাফাৰ (Applichem) ত 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ৰ সৈতে 4 ঘন্টা ইনকিউবেট কৰা হৈছিল, তাৰ পিছত 2 ঘন্টা ধুই দিয়া হৈছিল। ০.১ এম কোকামাইড বাফাৰেৰে ৩ বাৰ পুনৰাবৃত্তি কৰক। ইয়াৰ পিছত ইথানলৰ আৰোহী শৃংখলাটো ব্যৱহাৰ কৰি প্ৰতিটো ইথানলৰ দ্ৰৱ ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিট ইনকিউবেট কৰি কলাটো পানীমুক্ত কৰা হ’ল। কলাটো প্ৰপাইলিন অক্সাইডলৈ স্থানান্তৰিত কৰি ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ইপিঅ’এন (চিগমা-এলড্ৰিচ)ত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰা হ’ল। কলাটো সতেজ ইপিঅ’নত কোঠাৰ উষ্ণতাত ২ ঘণ্টা ৰাখক, আৰু তাৰ পিছত ৬২ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৭২ ঘণ্টা ধৰি ৰাখক। ৭০ এন এম অতিপাতল অংশ কাটিবলৈ আল্ট্ৰামাইক্ৰ’টম (Leica Microsystems, UC6) আৰু হীৰা কটাৰী (Diatome, Biel, Switzerland) ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিটৰ বাবে ১.৫% ইউৰেনাইল এচিটেটেৰে ৰং কৰক, আৰু সীহৰ চাইট্ৰেট দ্ৰৱৰে ৪ মিনিট ৰং কৰক। ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰ’গ্ৰাফসমূহ কেমেৰা ৱানভিউ ৪কে ১৬-বিট (গাটান) আৰু ডিজিটেলমাইক্ৰ’গ্ৰাফ চফটৱেৰ (গাটান)ৰে সজ্জিত জেইএম-২১০০ প্লাছ ট্ৰেন্সমিছন ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰস্কোপ (জেঅ’এল) ব্যৱহাৰ কৰি লোৱা হৈছিল। বিশ্লেষণৰ বাবে ৫০০০× বা ১০,০০০× ডিজিটেল জুমৰ সহায়ত ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰ’গ্ৰাফ আহৰণ কৰা হৈছিল।
মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ৰূপতাত্ত্বিক বিশ্লেষণ। সকলো বিশ্লেষণৰ বাবে, ব্যক্তিগত মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ কনট্যুৰসমূহ ImageJ চফট্ ৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি ডিজিটেল ছবিত হাতেৰে ৰূপৰেখা কৰা হৈছিল। বিভিন্ন ৰূপতাত্ত্বিক পৰিমাপ বিশ্লেষণ কৰা হয়। মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ঘনত্বক প্ৰতিটো কোষৰ মুঠ মাইট’কণ্ড্ৰিয়াল ক্ষেত্ৰফলক চাইট’প্লাজম এলেকা (চাইট’প্লাজম এলেকা = কোষৰ এলেকা-কোষৰ নিউক্লিয়াছ এলেকা) × ১০০ ৰে ভাগ কৰি পোৱা শতাংশ হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়। মাইট’কণ্ড্ৰিয়াৰ ইষ্টা মৰ্ফ’লজী বিশ্লেষণ কৰি ইয়াৰ মূল আকৃতি অনুসৰি দুটা ভাগত (“টিউব্যুলাৰ” আৰু “ফোহা”) ভাগ কৰা হৈছিল।
অটোফেগ’জম/লাইছ’জমৰ সংখ্যা আৰু ঘনত্ব বিশ্লেষণ। ডিজিটেল ছবিখনত প্ৰতিটো অটোফেগ'জম/লাইছ'জমৰ কনট্যুৰসমূহ নিজেই ৰূপৰেখা প্ৰস্তুত কৰিবলৈ ImageJ চফ্টৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰক। প্ৰতিটো কোষৰ মুঠ অটোফেগ’জম/লাইছ’জম গঠন ক্ষেত্ৰফলক চাইট’প্লাজম এলেকা (চাইট’প্লাজম এলেকা=কোষৰ ক্ষেত্ৰফল-নিউক্লিয়াছ এলেকা)×১০০ৰে ভাগ কৰি গণনা কৰা শতাংশ হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়। অটোফেগ’জম/লাইছ’জমৰ ঘনত্ব প্ৰতিটো কোষৰ অটোফেগ’জম/লাইছ’জমৰ গঠনৰ সংখ্যাৰে (চাইট’প্লাজমিক ক্ষেত্ৰফলৰ হিচাপত) (চাইট’প্লাজমিক এলেকা = কোষৰ ক্ষেত্ৰফল-নিউক্লিয়াৰ এলেকা) মুঠ সংখ্যাক ভাগ কৰি গণনা কৰা হয়।
তীব্ৰ ছেকচনিং আৰু নমুনা প্ৰস্তুতৰ বাবে লেবেলিং। গ্লুক’জ লেবেলিঙৰ প্ৰয়োজন হোৱা পৰীক্ষাৰ বাবে তীব্ৰ মগজুৰ স্লাইচবোৰ প্ৰি-ইনকিউবেচন চেম্বাৰলৈ স্থানান্তৰিত কৰক, য’ত চেচুৰেটেড কাৰ্বন (৯৫% O2 আৰু ৫% CO2), উচ্চ Ca2 + ACSF (১২৫.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম ফছফেট বাফাৰ, ২৫.০ মিলিমিটাৰ NaHCO 3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ থাকে d-গ্লুক’জ, ১.০ মিলিমিটাৰ CaCl ২ আৰু ২.০ মিলিমিটাৰ MgCl ২, pH ৭.৪ আৰু ৩১০ৰ পৰা ৩২০ mOsm লৈ সামঞ্জস্য কৰা), য’ত গ্লুক’জ ১৩ C ৬- গ্লুক’জ প্ৰতিস্থাপন (ইউৰিছ’টপ, কেটেলগ নম্বৰ CLM-১৩৯৬)। পাইৰুভেট লেবেলিঙৰ প্ৰয়োজন হোৱা পৰীক্ষাৰ বাবে তীব্ৰ মগজুৰ স্লাইচবোৰ উচ্চ Ca2 + ACSF (১২৫.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম ফছফেট বাফাৰ, ২৫.০ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ d-গ্লুক’জ, ১.০ মিলিমিটাৰ CaCl2 আৰু ২.০ মিলিমিটাৰ যোগ কৰক)লৈ স্থানান্তৰিত কৰক MgCl2, pH 7.4 আৰু 310 ৰ পৰা 320mOsm লৈ সামঞ্জস্য কৰক, আৰু 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, কেটেলগ নম্বৰ CLM-1082) যোগ কৰক। ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৯০ মিনিটৰ বাবে অংশবোৰ ইনকিউবেট কৰক। পৰীক্ষাৰ শেষত অংশবোৰ ৭৫ মিলিমিটাৰ এমোনিয়াম কাৰ্বনেট যুক্ত জলীয় দ্ৰৱ (pH ৭.৪) দ্বাৰা দ্ৰুতভাৱে ধুই পেলোৱা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ৪০:৪০:২০ (v:v:v) এচিট’নাইট্ৰাইল (ACN): মিথানল: পানীত সমতা স্থাপন কৰা হৈছিল। ৩০ মিনিট বৰফৰ ওপৰত অংশবোৰ ইনকিউবেট কৰাৰ পিছত নমুনাবোৰ ২১,০০০ গ্ৰামত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰা হয় আৰু স্পষ্ট চুপাৰনেটেণ্টটো স্পীডভেক কনচেণ্ট্ৰেটৰত শুকুৱাই লোৱা হয়। ফলত শুকান বিপাকীয় পদাৰ্থৰ পেলেটটো বিশ্লেষণ নোহোৱালৈকে -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল।
১৩টা C-লেবেলযুক্ত এমিনো এচিডৰ লিকুইড ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী-গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান বিশ্লেষণ। লিকুইড ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী-মাছ স্পেকট্ৰ’মেট্ৰি (LC-MS) বিশ্লেষণৰ বাবে বিপাকীয় পদাৰ্থৰ পেলেটটো ৭৫μl এল চি-এম এছ গ্ৰেডৰ পানীত (হানিৱেল) পুনৰ স্থলবন্দী কৰা হৈছিল। ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২১,০০০ গ্ৰামত ৫ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰাৰ পিছত ২০ μl স্পষ্ট চুপাৰনেটেণ্ট এমিনো এচিড ফ্লাক্স বিশ্লেষণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয়, আনহাতে বাকী নিষ্কাশন তৎক্ষণাত এনিয়ন বিশ্লেষণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয় (তলত চাওক)। পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা বেনজ’ইল ক্লৰাইড ডেৰাইভেটাইজেচন প্ৰট’কল (৫৫, ৫৬) ব্যৱহাৰ কৰি এমিনো এচিড বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। প্ৰথম পদক্ষেপত ২০μl বিপাকীয় পদাৰ্থৰ নিষ্কাশনত ১০μl ১০০ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম কাৰ্বনেট (চিগমা-এলড্ৰিচ) যোগ কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ১০μl ২% বেনজ’ইল ক্লৰাইড (চিগমা-এলড্ৰিচ) এল চি গ্ৰেড এচিএনত যোগ কৰা হৈছিল। নমুনাটোক চমুকৈ ভৰটেক্স কৰি তাৰ পিছত ২১,০০০ গ্ৰামত ২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৫ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰা হ’ল। ক্লিয়াৰ কৰা চুপাৰনেটেণ্টক শঙ্কুৰ দৰে কাঁচৰ ইনছাৰ্ট (২০০ μl আয়তন)ৰ সৈতে ২ মিলিলিটাৰ অটোচেম্পলাৰ শিশলৈ স্থানান্তৰ কৰক। নমুনাসমূহ Q-Exactive (QE)-HF (Altra High Field Orbitrap) হাই-ৰিজ’লিউচন প্ৰিচিচন মাছ স্পেকট্ৰ’মিটাৰ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ৰ সৈতে সংযুক্ত একুইটি আইক্লাছ আল্ট্ৰা-হাই পাৰফৰমেন্স এল চি চিষ্টেম (ৱাটাৰ্ছ) ব্যৱহাৰ কৰি বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। বিশ্লেষণৰ বাবে ডেৰাইভেটাইজড নমুনাৰ ২μl ১.৮μm কণা থকা ১০০×১.০ মিলিমিটাৰ উচ্চ শক্তিৰ চিলিকা T3 স্তম্ভ (Waters)ত বেজী দিয়া হৈছিল। প্ৰবাহৰ হাৰ ১০০μl/মিনিট, আৰু বাফাৰ ব্যৱস্থাটো বাফাৰ A (পানীত ১০ মিলিমিটাৰ এমোনিয়াম ফৰ্মেট আৰু ০.১৫% ফৰ্মিক এচিড) আৰু বাফাৰ বি (ACN)ৰে গঠিত। গ্ৰেডিয়েণ্ট তলত দিয়া ধৰণৰ: ০ মিনিটত ০%B; ০%খ। ০ৰ পৰা ০.১ মিনিটত ০ৰ পৰা ১৫% বি; ০.১ৰ পৰা ০.৫ মিনিটত ১৫ৰ পৰা ১৭% বি; বি ১৭ৰ পৰা ৫৫% ০.৫ৰ পৰা ১৪ মিনিটত; ১৪ৰ পৰা ১৪.৫ মিনিটত ৫৫ৰ পৰা ৭০% বি; ১৮ মিনিটত ১৪.৫ৰ পৰা ৭০ৰ পৰা ১০০% বিত; ১৮ৰ পৰা ১৯ মিনিটত ১০০% বি; ১৯ৰ পৰা ১৯.১ মিনিটত ১০০ৰ পৰা ০% বি; ১৯.১ৰ পৰা ২৮ মিনিটত ০% বি (৫৫, ৫৬)। QE-HF গণ বৰ্ণালীমাপকে ধনাত্মক আয়নীয়কৰণ ধৰণত কাম কৰে আৰু ইয়াৰ ভৰ পৰিসৰ m/z (ভৰ/আধান অনুপাত) ৫০ৰ পৰা ৭৫০। প্ৰয়োগ কৰা ৰিজ'লিউচন ৬০,০০০, আৰু লাভ কৰা লাভ নিয়ন্ত্ৰণ (AGC) আয়ন লক্ষ্য ৩×১০৬, আৰু সৰ্বোচ্চ আয়ন সময় ১০০ মিলিছেকেণ্ড। উত্তাপিত ইলেক্ট্ৰ’স্প্ৰে আয়নীয়কৰণ (ESI) উৎসটোৱে ৩.৫ কেভি স্প্ৰে ভল্টেজ, ২৫০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ কেপিলাৰী উষ্ণতা, ৬০ এউ (ইচ্ছাকৃত ইউনিট) আৱৰণৰ বায়ুপ্ৰবাহ আৰু ২০ এউৰ সহায়ক বায়ুপ্ৰবাহত কাম কৰে। ২৫০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ। S লেন্স 60 AU ত ছেট কৰা হৈছে।
১৩চি লেবেলযুক্ত জৈৱিক এচিডৰ এনিয়ন ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী-এম এছ বিশ্লেষণ। বাকী থকা বিপাকীয় পদাৰ্থৰ বৰষুণ (৫৫μl) QE-HF গণ বৰ্ণালীমাপক (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ৰ সৈতে সংযুক্ত ডাইঅ’নেক্স আয়ন ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী ব্যৱস্থা (ICS 5000+, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ব্যৱহাৰ কৰি বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। মুঠতে, 5μl বিপাকীয় নিষ্কাশন HPLC (2 mm×250 মিমি, কণিকাৰ আকাৰ 4μm, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) দ্বাৰা সজ্জিত এটা Dionex IonPac AS11-HC কলামত 1 ৰ ভৰোৱাৰ অনুপাতৰ সৈতে পুছ-ইন আংশিক লুপ মোডত ইনজেকচন কৰা হৈছিল। ) Dionex IonPac AG11-HC গাৰ্ড কলাম (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo ফিচাৰ চাইন্টিফিক)। স্তম্ভৰ উষ্ণতা ৩০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰখা হয়, আৰু অটোচেম্পলাৰ ৬ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত স্থাপন কৰা হয়। এলুয়েণ্ট জেনেৰেটৰৰ জৰিয়তে পটাছিয়াম হাইড্ৰ’ক্সাইড গ্ৰেডিয়েণ্ট সৃষ্টি কৰিবলৈ বিআয়নীকৃত পানীৰ সৈতে প্ৰদান কৰা পটাছিয়াম হাইড্ৰ’ক্সাইড কাৰ্টিজ ব্যৱহাৰ কৰক। ৩৮০μl/মিনিটৰ প্ৰবাহৰ হাৰত বিপাকীয় পদাৰ্থ পৃথক কৰা, তলত দিয়া গ্ৰেডিয়েণ্ট প্ৰয়োগ কৰি: ০ৰ পৰা ৩ মিনিট, ১০ মিলিমিটাৰ KOH; ৩ৰ পৰা ১২ মিনিট, ১০ৰ পৰা ৫০ মিলিমিটাৰ KOH; ১২ৰ পৰা ১৯ মিনিট, ৫০ৰ পৰা ১০০ মিলিমিটাৰ KOH; ১৯ৰ পৰা ২১ মিনিট , ১০০ মিলিমিটাৰ KOH; ২১ৰ পৰা ২১.৫ মিনিট, ১০০ৰ পৰা ১০ মিলিমিটাৰ KOH। স্তম্ভটো ১০ মিলিমিটাৰ KOH ৰ অধীনত ৮.৫ মিনিটৰ বাবে পুনৰ সমতা স্থাপন কৰা হ’ল।
এলুট কৰা বিপাকীয় পদাৰ্থবোৰ স্তম্ভৰ পিছত ১৫০μl/মিনিট আইছ’প্ৰ’পেনল পৰিপূৰক প্ৰবাহৰ সৈতে সংযুক্ত কৰা হয় আৰু তাৰ পিছত ঋণাত্মক আয়নীয়কৰণ ধৰণত কাম কৰা উচ্চ-ৰিজ’লিউচন গণ বৰ্ণালীমাপকলৈ নিৰ্দেশিত কৰা হয়। এম এছ ৬০,০০০ ৰিজ’লিউচনৰ সৈতে m/z ৫০ৰ পৰা ৭৫০লৈকে ভৰৰ পৰিসৰ নিৰীক্ষণ কৰি আছে। AGC 1×106 হিচাপে নিৰ্ধাৰণ কৰা হয়, আৰু সৰ্বোচ্চ আয়ন সময় 100 ms ত ৰখা হয়। গৰম কৰা ই এছ আই উৎসটো ৩.৫ কেভি স্প্ৰে ভল্টেজত চলোৱা হৈছিল। আয়নৰ উৎসৰ আন ছেটিংছসমূহ হ’ল: কেপিলাৰী উষ্ণতা ২৭৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ; আৱৰণ গেছৰ প্ৰবাহ, ৬০ এউ; সহায়ক গেছৰ প্ৰবাহ, 300°C ত 20 AU, আৰু S লেন্স 60 AU লৈ ছেট কৰা।
১৩চি লেবেলযুক্ত বিপাকীয় পদাৰ্থৰ তথ্য বিশ্লেষণ। আইছ'ট'প অনুপাতৰ তথ্য বিশ্লেষণৰ বাবে ট্ৰেচফাইণ্ডাৰ চফ্টৱেৰ (সংস্কৰণ ৪.২, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ব্যৱহাৰ কৰক। প্ৰতিটো যৌগৰ পৰিচয় নিৰ্ভৰযোগ্য ৰেফাৰেন্স যৌগৰ দ্বাৰা পৰীক্ষা কৰা হৈছিল আৰু স্বতন্ত্ৰভাৱে বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। আইছ'ট'প সমৃদ্ধি বিশ্লেষণ কৰিবলৈ প্ৰতিটো 13C আইছ'ট'পৰ (Mn) নিষ্কাশিত আয়ন ক্ৰমেট'গ্ৰাম (XIC)ৰ ক্ষেত্ৰফল [M + H] + ৰ পৰা নিষ্কাশন কৰা হৈছিল, য'ত n হৈছে লক্ষ্য যৌগটোৰ কাৰ্বন সংখ্যা, যিটো এমিনো এচিড বিশ্লেষণ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয় বা [ MH] + এনিয়ন বিশ্লেষণ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। XIC ৰ ভৰ সঠিকতা প্ৰতি মিলিয়নত পাঁচ অংশতকৈ কম, আৰু RT ৰ সঠিকতা ০.০৫ মিনিট। প্ৰতিটো ধৰা পৰা আইছ’ট’পৰ অনুপাত আৰু সংশ্লিষ্ট যৌগটোৰ সকলো আইছ’ট’পৰ যোগফল গণনা কৰি সমৃদ্ধি বিশ্লেষণ কৰা হয়। এই অনুপাতসমূহ প্ৰতিটো আইছ'ট'পৰ বাবে শতাংশ মান হিচাপে দিয়া হৈছে, আৰু ফলাফলসমূহ পূৰ্বে বৰ্ণনা কৰা ধৰণে মোলাৰ শতাংশ সমৃদ্ধি (MPE) হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হৈছে (৪২)।
হিমায়িত নিউৰন পেলেটটো বৰফৰ দৰে ঠাণ্ডা ৮০% মিথানলত (v/v) সমতা স্থাপন কৰা হৈছিল, ভৰটেক্স কৰা হৈছিল আৰু -২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৩০ মিনিট ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। নমুনাটো আকৌ ভৰটেক্স কৰি +৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৩০ মিনিট লৰাই থাকিব। নমুনাটো ২১,০০০ গ্ৰামত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৫ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত পোৱা চুপাৰনেটেণ্ট সংগ্ৰহ কৰি ২৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত স্পীডভেক কনচেণ্ট্ৰেটৰ ব্যৱহাৰ কৰি পৰৱৰ্তী বিশ্লেষণৰ বাবে শুকুৱাই লোৱা হৈছিল। ওপৰত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, সজাই পৰাই লোৱা কোষবোৰৰ এমিনো এচিডৰ ওপৰত এল চি-এম এছ বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। ট্ৰেচফাইণ্ডাৰ (সংস্কৰণ ৪.২, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) ব্যৱহাৰ কৰি প্ৰতিটো যৌগৰ মনোআইছ’ট’পিক ভৰ ব্যৱহাৰ কৰি তথ্য বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। বিপাকীয় তথ্যৰ কোৱাণ্টাইল স্বাভাৱিককৰণ preprocessCore চফট্ ৱেৰ পেকেজ ব্যৱহাৰ কৰি সম্পন্ন কৰা হৈছিল (57)।
স্লাইচ প্ৰস্তুত কৰা। মাউছটোক কাৰ্বন ডাই অক্সাইডেৰে দ্ৰুতভাৱে অজ্ঞান কৰি মূৰ কাটি পেলোৱা হৈছিল, মগজুটো দ্ৰুতভাৱে মূৰৰ খুলিৰ পৰা আঁতৰাই পেলোৱা হৈছিল আৰু বৰফেৰে ভৰা কম্পন কটাৰী (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ব্যৱহাৰ কৰি ইয়াক ৩০০ৰ পৰা ৩৭৫ μm চেজিটেল অংশত কাটি লোৱা হৈছিল Cold carbon gasification (95% O2 আৰু 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (১২৫.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম ফছফেট বাফাৰ, ২৫.০ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ d-গ্লুক’জ, ১.০ মিলিমিটাৰ CaCl2 আৰু ৬.০ মিলিমিটাৰ MgCl2 pH ৭.৪ আৰু ৩১০ৰ পৰা ৩৩০ মিলিগ্ৰামত সামঞ্জস্য স্থাপন কৰক)। পোৱা মগজুৰ স্লাইচবোৰ অধিক Ca2 + ACSF (১২৫.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ২.৫ মিলিমিটাৰ KCl, ১.২৫ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম ফছফেট বাফাৰ, ২৫.০ মিলিমিটাৰ NaHCO3, ২৫.০ মিলিমিটাৰ d-গ্লুক’জ, ৪.০ মিলিমিটাৰ CaCl2 আৰু mM ৩.৫ MgCl2) pH ৭.৪ আৰু যুক্ত কক্ষলৈ স্থানান্তৰিত কৰক ৩১০ৰ পৰা ৩২০ মিলিঅ’এছএম)। ২০ৰ পৰা ৩০ মিনিটৰ বাবে স্লাইচবোৰ সংৰক্ষণ কৰক যাতে ৰেকৰ্ডিং কৰাৰ আগতে পুনৰুদ্ধাৰ কৰিব পৰা যায়।
ৰেকৰ্ডিং। সকলো ৰেকৰ্ডিঙৰ বাবে এটা নিৰ্দিষ্ট ৰেকৰ্ডিং চেম্বাৰ আৰু ২০x পানীত ডুবাই ৰখা বস্তুনিষ্ঠ লেন্স (Scientifica)ৰে সজ্জিত মাইক্ৰস্কোপ ষ্টেজ ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। (i) শৰীৰৰ আকাৰ, (ii) মস্তিষ্কৰ শাৰীৰিক অৱস্থান, আৰু (iii) ফ্লু’ৰেচেণ্ট mtYFP ৰিপ’ৰ্টাৰ জিনৰ প্ৰকাশৰ দ্বাৰা অনুমানিক পুৰকিঞ্জে কোষ চিনাক্ত কৰা হৈছিল। ৫ৰ পৰা ১১ মেগ’ম টিপ ৰেজিষ্টেন্সৰ পেচ পিপেটটো ব’ৰ’চিলিকেট গ্লাছ কেপিলাৰী (জিবি১৫০-১০, ০.৮৬ মিলিমিটাৰ×১.৫ মিলিমিটাৰ×১০০ মিলিমিটাৰ, চাইন্স প্ৰডাক্টছ, হফহেইম, জাৰ্মানী) আৰু অনুভূমিক পিপেট ইনষ্ট্ৰুমেণ্টছ (পি-১০০০, ছাটাৰ), নোভাটো, চি.এ. সকলো ৰেকৰ্ডিং ELC-03XS npi পেচ ক্লেম্প এম্প্লিফায়াৰ (npi electronic GmbH, Tam, Germany) দ্বাৰা কৰা হৈছিল, যিটো চফট্ ৱেৰ Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) দ্বাৰা নিয়ন্ত্ৰিত হৈছিল। পৰীক্ষাটো ১২.৫ কিলোহাৰ্টজৰ নমুনা সংগ্ৰহৰ হাৰত ৰেকৰ্ড কৰা হৈছিল। সংকেতটো ক্ৰমে ১.৩ আৰু ১০ কিলোহাৰ্টজৰ কাটঅফ ফ্ৰিকুৱেন্সিৰ দুটা শ্বৰ্ট-পাছ বেচেল ফিল্টাৰৰ সহায়ত ফিল্টাৰ কৰা হয়। মেমব্ৰেন আৰু পিপেটৰ ​​ধাৰণক্ষমতা এম্প্লিফায়াৰ ব্যৱহাৰ কৰি ক্ষতিপূৰণ বৰ্তনীৰ দ্বাৰা ক্ষতিপূৰণ কৰা হয়। সকলো পৰীক্ষা অৰ্কা-ফ্লেছ ৪.০ কেমেৰা (হামামাটছু, গেৰ্ডেন, জাৰ্মানী)ৰ নিয়ন্ত্ৰণত কৰা হৈছিল, যিটো হোকাও চফট্ ৱেৰ (সংস্কৰণ ২.৮, হামামাটছু, গেৰ্ডেন, জাৰ্মানী)ৰ দ্বাৰা নিয়ন্ত্ৰিত হৈছিল।
ৰুটিন গোটেই-কোষ সংৰূপ আৰু বিশ্লেষণ। ৰেকৰ্ডিং কৰাৰ ঠিক আগতে পিপেটটোত তলত দিয়া পদাৰ্থসমূহ থকা আভ্যন্তৰীণ দ্ৰৱটো ভৰাই লওক: ৪.০ মিলিমিটাৰ কেচিএল, ২.০ মিলিমিটাৰ NaCl, ০.২ মিলিমিটাৰ ইজিটিএ, ১৩৫.০ মিলিমিটাৰ পটাছিয়াম গ্লুকনেট, ১০.০ মিলিমিটাৰ হেপেছ, ৪.০ মিলিমিটাৰ এটিপি (Mg), ০.৫ মিলিমিটাৰ গুয়ান’চিন ট্ৰাইফছফেট (জিটিপি) (Na) আৰু ১০.০ মিলিমিটাৰ ক্ৰিয়েটিনিন ফছফেটক pH ৭.২৫ লৈ সামঞ্জস্য কৰা হৈছিল, আৰু অস্মোটিক চাপ আছিল ২৯০ মিলিঅ’এছএম (চুক্ৰ’জ)। পৰ্দাখন ফাটিবলৈ ০ পিএ বল প্ৰয়োগ কৰাৰ লগে লগে জিৰণি লোৱা আৱৰণৰ বিভৱ জুখিব পৰা গ’ল। -40, -30, -20, আৰু -10 pA ৰ হাইপাৰপ’লাৰাইজড কাৰেণ্ট প্ৰয়োগ কৰি ইনপুট ৰেজিষ্টেন্স জুখিব পাৰি। ভল্টেজ প্ৰতিক্ৰিয়াৰ পৰিমাণ জুখি ইনপুট ৰেজিষ্টেন্স গণনা কৰিবলৈ ওমৰ নিয়ম ব্যৱহাৰ কৰক। ৫ মিনিটৰ বাবে ভল্টেজ ক্লেম্পত স্বতঃস্ফূৰ্ত কাৰ্য্যকলাপ ৰেকৰ্ড কৰা হৈছিল, আৰু অৰ্ধ-স্বয়ংক্ৰিয় চিনাক্তকৰণ লিপি ব্যৱহাৰ কৰি ইগ'ৰ প্ৰ' (সংস্কৰণ ৩২ ৭.০১, ৱেভমেট্ৰিক্স, লেক অছৱেগো, অৰেগন, আমেৰিকা)ত sPSC চিনাক্ত আৰু জুখিছিল। IV বক্ৰ আৰু স্থিৰ অৱস্থাৰ কাৰেণ্ট বেটাৰীক বিভিন্ন বিভৱত ক্লেম্প কৰি (-110 mV ৰ পৰা আৰম্ভ কৰি) আৰু 5 mV পদক্ষেপত ভল্টেজ বৃদ্ধি কৰি জুখিব পাৰি। ডিপ’লাৰাইজিং কাৰেণ্ট প্ৰয়োগ কৰি এ পি উৎপাদন পৰীক্ষা কৰা হৈছিল। ডিপ’লাৰাইজিং কাৰেণ্ট পালছ প্ৰয়োগ কৰাৰ সময়ত কোষটোক -৭০ মিলিভোল্টত ক্লেম্প কৰক। প্ৰতিটো ৰেকৰ্ডিং ইউনিটৰ ষ্টেপ আকাৰ পৃথকে পৃথকে সামঞ্জস্য কৰক (১০ৰ পৰা ৬০ পিএ)। সৰ্বোচ্চ এ পি কম্পাঙ্ক সৃষ্টি কৰা পালছ স্পাইকসমূহ হস্তচালিতভাৱে গণনা কৰি সৰ্বোচ্চ এ পি কম্পাঙ্ক গণনা কৰক। এ পি থ্ৰেছহ’ল্ড বিশ্লেষণ কৰা হয় ডিপ’লাৰাইজেচন পালছৰ দ্বিতীয় ডেৰাইভেটিভ ব্যৱহাৰ কৰি যিয়ে প্ৰথমে এটা বা ততোধিক এ পি ট্ৰিগাৰ কৰে।
ছিদ্ৰযুক্ত পেচ সংৰূপ আৰু বিশ্লেষণ। প্ৰামাণিক প্ৰটোকলসমূহ ব্যৱহাৰ কৰি ছিদ্ৰযুক্ত পেচ ৰেকৰ্ডিং কৰক। তলত দিয়া উপাদানসমূহ নথকা ATP- আৰু GTP-মুক্ত পিপেট ব্যৱহাৰ কৰক: 128 mM গ্লুকনেট K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA আৰু 2 mM MgCl2, আৰু pH 7.2 লৈ সামঞ্জস্য কৰক (KOH ব্যৱহাৰ কৰি)। কোষৰ আৱৰণৰ অনিয়ন্ত্ৰিত পাৰ্যমান্যতা ৰোধ কৰিবলৈ আন্তঃকোষীয় দ্ৰৱৰ পৰা এ টি পি আৰু জি টি পি বাদ দিয়া হয়। পেচ পিপেটত এম্ফোটেৰিচিন যুক্ত আভ্যন্তৰীণ দ্ৰৱ (প্ৰায় ২০০ৰ পৰা ২৫০μg/ml; G4888, চিগমা-এলড্ৰিচ) ভৰাই পাঞ্চ কৰা পেচ ৰেকৰ্ড লাভ কৰা হয়। এম্ফোটেৰিচিন ডাইমিথাইল ছালফক্সাইডত দ্ৰৱীভূত কৰা হৈছিল (চূড়ান্ত ঘনত্ব: ০.১ৰ পৰা ০.৩%; ডিএমএছঅ’; ডি৮৪১৮, চিগমা-এলড্ৰিচ)। ব্যৱহৃত ডি এম এছ অ’ৰ ঘনত্বই অধ্যয়ন কৰা নিউৰনসমূহৰ ওপৰত কোনো বিশেষ প্ৰভাৱ পেলাব পৰা নাছিল। পাঞ্চিং প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত চেনেল ৰেজিষ্টেন্স (Ra) অবিৰতভাৱে নিৰীক্ষণ কৰা হৈছিল, আৰু Ra আৰু AP ৰ প্ৰসাৰণ স্থিৰ হোৱাৰ পিছত (২০-৪০ মিনিট) পৰীক্ষা আৰম্ভ কৰা হৈছিল। স্বতঃস্ফূৰ্ত কাৰ্য্যকলাপ ভল্টেজ আৰু/বা কাৰেণ্ট ক্লেম্পত ২ৰ পৰা ৫ মিনিটৰ বাবে জুখিব পাৰি। তথ্য বিশ্লেষণ ইগ’ৰ প্ৰ’ (সংস্কৰণ ৭.০৫.২, ৱেভমেট্ৰিক্স, আমেৰিকা), এক্সেল (সংস্কৰণ ২০১০, মাইক্ৰ’ছফ্ট কৰ্প’ৰেশ্যন, ৰেডমণ্ড, আমেৰিকা) আৰু গ্ৰাফপেড প্ৰিজম (সংস্কৰণ ৮.১.২, গ্ৰাফপেড চফ্টৱেৰ ইনকৰ্পৰেশ্যন, লা জোলা, কে.এ.) ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হৈছিল। আমেৰিকা যুক্তৰাষ্ট্ৰ)। স্বতঃস্ফূৰ্ত এপি চিনাক্ত কৰিবলৈ, IgorPro ৰ NeuroMatic v3.0c প্লাগ-ইন ব্যৱহাৰ কৰা হয়। এটা প্ৰদত্ত থ্ৰেছহোল্ড ব্যৱহাৰ কৰি AP সমূহ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে চিনাক্ত কৰক, যি প্ৰতিটো ৰেকৰ্ডৰ বাবে পৃথকে পৃথকে সামঞ্জস্য কৰা হয়। স্পাইক ব্যৱধান ব্যৱহাৰ কৰি সৰ্বোচ্চ তৎক্ষণাত স্পাইক কম্পাঙ্ক আৰু গড় স্পাইক কম্পাঙ্কৰে স্পাইক কম্পাঙ্ক নিৰ্ণয় কৰক।
পি এন পৃথকীকৰণ। পূৰ্বতে প্ৰকাশিত প্ৰট'কলৰ সৈতে খাপ খুৱাই, পিএনসমূহক এটা নিৰ্দিষ্ট পৰ্যায়ত মাউছৰ চেৰিবেলামৰ পৰা বিশুদ্ধ কৰা হৈছিল (৫৮)। মুঠতে চেৰিবেলামটো বিভাজিত কৰি বৰফৰ দৰে ঠাণ্ডা বিচ্ছেদ মাধ্যমত [HBSS Ca2+ আৰু Mg2+ অবিহনে, ২০ মিলিমিটাৰ গ্লুক’জ, পেনিচিলিন (৫০ U/ml) আৰু ষ্ট্ৰেপ্ট’মাইচিন (০.০৫ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ)ৰ সৈতে পৰিপূৰক হিচাপে], আৰু তাৰ পিছত মাধ্যমটো পেপেইনত [HBSS, ১-চিষ্টাইন·HCl ৰ পৰিপূৰক হিচাপে হজম কৰা হ’ল (১ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ), পেপেইন (১৬ ইউ/মিলিলিটাৰ) আৰু ডিঅক্সিৰাইব’নিউক্লিয়েজ I (ডিনেজ I; ০.১ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ)] ৩০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৩০ মিনিটৰ বাবে শোধন কৰক। প্ৰথমে কণীৰ শ্লেষ্মা (১০ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ), বি এছ এ (১০ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ) আৰু ডি এন এজ (০.১ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ) যুক্ত এইচ বি এছ এছ মাধ্যমত এনজাইমেটিক হজম ৰোধ কৰিবলৈ কোঠাৰ উষ্ণতাত ধুব লাগে, আৰু তাৰ পিছত ২০ মিলিমিটাৰ গ্লুক’জ যুক্ত এইচ বি এছ এছ মাধ্যমত এইচ বি এছ এছ, পেনিচিলিন (৫০ ইউ/মিলিলিটাৰ), ষ্ট্ৰেপ্ট’মাইচিন (০.০৫ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ) আৰু লাহে লাহে পিহিব লাগে ডি এন এজে (০.১ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ) একক কোষ মুক্ত কৰে। তাৰ পিছত কোষবোৰক কেন্দ্ৰচালিত (১১১০ আৰ পি এম, ৫ মিনিট, ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ) দ্বাৰা পেলেট কৰা হৈছিল আৰু ছৰ্টিং মাধ্যমত [HBSS, ২০ মিলিমিটাৰ গ্লুক’জ, ২০% ভ্ৰুণৰ গৰু) ছিৰাম, পেনিচিলিন (৫০ ইউ/মিলিলিটাৰ) আৰু ষ্ট্ৰেপ্ট’মাইচিনৰ সৈতে পৰিপূৰক হিচাপে পুনৰ স্থলবন্দী কৰা হৈছিল (০.০৫ মিলিগ্ৰাম/মিলিলিটাৰ)]; প্ৰপিডিয়াম আয়'ডাইডৰ সহায়ত কোষৰ জীৱন ক্ষমতা মূল্যায়ন কৰা আৰু কোষৰ ঘনত্ব ১×১০৬ৰ পৰা ২×১০৬ কোষ/মিলিলিটাৰলৈ সামঞ্জস্য কৰা। ফ্ল’ চাইট’মেট্ৰিৰ আগতে ৫০ মাইক্ৰ’মিটাৰ কোষ ষ্ট্ৰেইনাৰৰ জৰিয়তে স্থলবন্দী ফিল্টাৰ কৰা হৈছিল।
ফ্ল’ চাইট’মিটাৰ। FACSAria III মেচিন (BD Biosciences) আৰু FACSDiva চফট্ ৱেৰ (BD Biosciences, সংস্কৰণ 8.0.1) ব্যৱহাৰ কৰি 4°C ত কোষ সজাই পৰাই কৰা হৈছিল। 100 μm নজেল ব্যৱহাৰ কৰি 20 psi চাপত ~2800 ইভেন্ট/ছেকেণ্ডৰ হাৰত কোষৰ স্থলবন্দী ভাগ কৰা হৈছিল। যিহেতু পৰম্পৰাগত গেটিং মাপকাঠী (কোষৰ আকাৰ, বাইম'ডাল বৈষম্য, আৰু বিকিৰণ বৈশিষ্ট্য) অন্য কোষ প্ৰকাৰৰ পৰা পিএন সঠিক পৃথকীকৰণ নিশ্চিত কৰিব নোৱাৰে, গেটিং কৌশল মাইট'ৱাইএফপি+ আৰু নিয়ন্ত্ৰণ মাইট'ৱাইএফপি − এন্দুৰত ৱাইএফপি তীব্ৰতা আৰু অটোফ্ল'ৰেচেন্সৰ প্ৰত্যক্ষ তুলনাৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি নিৰ্ধাৰণ কৰা হয়। 488 nm লেজাৰ লাইনেৰে নমুনাটোক বিকিৰণ কৰি YFP উত্তেজিত কৰা হয়, আৰু 530/30 nm বেণ্ড পাছ ফিল্টাৰ ব্যৱহাৰ কৰি সংকেত ধৰা পেলোৱা হয়। মাইট’ৱাইএফপি+ এন্দুৰত Rosa26-মাইট’ৱাইএফপি ৰিপ’ৰ্টাৰ জিনৰ আপেক্ষিক শক্তিও স্নায়ুকোষীয় শৰীৰ আৰু এক্সন খণ্ড পৃথক কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। 7-AAD 561 nm হালধীয়া লেজাৰেৰে উত্তেজিত কৰা হয় আৰু 675/20 nm বেণ্ডপাছ ফিল্টাৰৰ সহায়ত ধৰা পেলোৱা হয় যাতে মৃত কোষক বাদ দিয়া হয়। একে সময়তে এষ্ট্ৰ’চাইট পৃথক কৰিবলৈ কোষৰ স্থলবন্দীক ACSA-2-APC ৰে ৰং কৰা হৈছিল, তাৰ পিছত নমুনাটোক ৬৪০ এন এম লেজাৰ লাইনেৰে বিকিৰণ কৰা হৈছিল আৰু সংকেত ধৰা পেলাবলৈ ৬৬০/২০ এন এম বেণ্ডপাছ ফিল্টাৰ ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল।
সংগ্ৰহ কৰা কোষবোৰক কেন্দ্ৰচালিত (১১১০ আৰ পি এম, ৫ মিনিট, ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ) দ্বাৰা পেলেট কৰি ব্যৱহাৰ নোহোৱালৈকে -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল। Mfn2cKO এন্দুৰ আৰু ইয়াৰ আৱৰ্জনা পোৱালিক একেদিনাই শ্ৰেণীভুক্ত কৰা হয় যাতে পদ্ধতিগত পৰিৱৰ্তনশীলতা কম হয়। FACS তথ্য উপস্থাপন আৰু বিশ্লেষণ FlowJo চফট্ ৱেৰ (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হৈছিল।
ওপৰত উল্লেখ কৰা অনুসৰি (৫৯), পৰৱৰ্তী mtDNA পৰিমাণ নিৰ্ণয়ৰ বাবে সজাই পৰাই লোৱা নিউৰনৰ পৰা ডি এন এ পৃথক কৰিবলৈ বাস্তৱ সময়ৰ পিচিআৰ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। প্ৰথমতে বিভিন্ন সংখ্যক কোষত qPCR চলাই ৰৈখিকতা আৰু থ্ৰেছহ’ল্ড সংবেদনশীলতা পৰীক্ষা কৰা হৈছিল। মুঠতে ৫০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৮.৫), ১ মিলিমিটাৰ ইডিটিএ, ০.৫% টুইন ২০ আৰু প্ৰটিনেজ কে (২০০ এনজি/মিলিলিটাৰ)ৰে গঠিত লাইছিছ বাফাৰত ৩০০ পিএন সংগ্ৰহ কৰি ৫৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১২০ মিনিট ইনকিউবেট কৰক। কোষবোৰক ৯৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১০ মিনিটৰ বাবে ইনকিউবেট কৰি প্ৰটিনেজ কে সম্পূৰ্ণৰূপে নিষ্ক্ৰিয় কৰাটো নিশ্চিত কৰা হয়।mt-Nd1ৰ বাবে নিৰ্দিষ্ট TaqMan প্ৰ’ব (থাৰ্মো ফিচাৰ) ব্যৱহাৰ কৰি ৭৯০০HT ৰিয়েল-টাইম পিচিআৰ ব্যৱস্থাত (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) অৰ্ধ-পৰিমাণগত পিচিআৰৰ দ্বাৰা mtDNA জুখিব পৰা যায়। বিজ্ঞান, কেটেলগ নম্বৰ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, কেটেলগ নম্বৰ AIVI3E8) আৰু 18S (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, কেটেলগ নম্বৰ Hs99999901_s1) জিন।
প্ৰটিঅ’মৰ নমুনা প্ৰস্তুত কৰা। 10 মিনিটৰ বাবে 95°C ত দ্ৰৱ গৰম কৰি আৰু sonicating দ্বাৰা, লাইছিছ বাফাৰত [6 M guanidine chloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide আৰু 100 mM tris- HCl ত লাইজ ফ্ৰ'জেন নিউৰন পেলেট]। বায়'ৰপ্টৰ (ডাইজেন'ড) ১০ মিনিটৰ বাবে (৩০ ছেকেণ্ডৰ পালছ / ৩০ ছেকেণ্ডৰ বিৰতিৰ সময়) অন কৰক। নমুনাটো ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৮.০)ত ১:১০ পাতল কৰি ৩০০ এনজি ট্ৰিপচিন গোল্ড (প্ৰ’মেগা)ৰ সৈতে মিহলাই ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰি সম্পূৰ্ণ হজম কৰা হ’ল। দ্বিতীয় দিনা নমুনাটো ২০,০০০ গ্ৰামত ২০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰা হ’ল। চুপাৰনেটেণ্টটো ০.১% ফৰ্মিক এচিডেৰে পাতল কৰা হ’ল, আৰু দ্ৰৱটো স্ব-নিৰ্মিত ষ্টেজটিপছৰ দ্বাৰা নিমখমুক্ত কৰা হ’ল। নমুনাটো SpeedVac যন্ত্ৰত (Eppendorf concentrator plus 5305) ৪৫ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত শুকুৱাই লোৱা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত পেপটাইডটো ০.১% ফৰ্মিক এচিডত স্থলবন্দী কৰা হৈছিল। সকলো নমুনা একেলগে একেজন ব্যক্তিয়ে প্ৰস্তুত কৰিছিল। এষ্ট্ৰ'চাইটৰ নমুনা বিশ্লেষণ কৰিবলৈ ৪ μg নিমখমুক্ত পেপটাইডক টেণ্ডেম মাছ টেগ (টিএমটি১০প্লেক্স, কেটেলগ নম্বৰ ৯০১১০, থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ৰ সৈতে লেবেল কৰা হৈছিল আৰু পেপটাইড আৰু টিএমটি ৰিএজেণ্টৰ অনুপাত ১:২০ আছিল। টিএমটি লেবেলিঙৰ বাবে ০.৮ মিলিগ্ৰাম টিএমটি ৰিএজেণ্টক ৭০ μl জলহীন এচিএনত পুনৰ স্থলবন্দী কৰা হৈছিল, আৰু শুকান পেপটাইডটোক ৯ μl ০.১ এম টিইএবি (ট্ৰাইইথাইলএমোনিয়াম বাইকাৰ্বনেট)ত পুনৰ গঠন কৰা হৈছিল, য’ত এচিএনত ৭ μl টিএমটি ৰিএজেণ্ট যোগ কৰা হৈছিল। ঘনত্ব আছিল ৪৩.৭৫%। ৬০ মিনিট ইনকিউবেচনৰ পিছত ২ μl ৫% হাইড্ৰক্সিলামাইনেৰে বিক্ৰিয়াটো বন্ধ কৰি দিয়া হ’ল। লেবেলযুক্ত পেপটাইডসমূহ সংগ্ৰহ কৰি শুকুৱাই ২০০μl ০.১% ফৰ্মিক এচিড (FA)ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি দুটা ভাগত ভাগ কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত স্ব-নিৰ্মিত ষ্টেজটিপছ ব্যৱহাৰ কৰি নিমখমুক্ত কৰা হৈছিল। আলটিমেট ৩০০০ আল্ট্ৰা হাই পাৰফৰমেন্স লিকুইড ক্ৰ'মেট'গ্ৰাফ (আলটিমেট ৩০০০ আল্ট্ৰা হাই পাৰফৰমেন্স লিকুইড ক্ৰ'মেট'গ্ৰাফ) ব্যৱহাৰ কৰি, দুটা অৰ্ধৰ এটাক ১৩০Å১.৭μm C১৮ কণাৰে ভৰা ১মিমি x ১৫০ মিলিমিটাৰ একুইটি ক্ৰ'মেট'গ্ৰাফিক কলামত ভগ্নাংশ কৰা হৈছিল (ৱাটাৰ্ছ, কেটেলগ নং SKU: ১৮৬০০৬৯৩৫)। থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)। ৩০μl/মিনিটৰ প্ৰবাহৰ হাৰত পেপটাইড পৃথক কৰক, ১%ৰ পৰা ৫০% বাফাৰ বিলৈ ৮৫ মিনিটৰ বাবে ৯৬ মিনিটৰ স্তৰভিত্তিক গ্ৰেডিয়েণ্টেৰে পৃথক কৰক, ৫০%ৰ পৰা ৯৫% বাফাৰ বিলৈ ৩ মিনিটৰ বাবে, তাৰ পিছত ৯৫ শতাংশ বাফাৰ বিৰ বাবে ৮ মিনিট; বাফাৰ A ৫% ACN আৰু ১০ মিলিমিটাৰ এমোনিয়াম বাইকাৰ্বনেট (ABC), আৰু বাফাৰ B ৮০% ACN আৰু ১০ মিলিমিটাৰ ABC। প্ৰতি ৩ মিনিটৰ মূৰে মূৰে ভগ্নাংশ সংগ্ৰহ কৰি দুটা গোটত (১ + ১৭, ২ + ১৮ ইত্যাদি) একত্ৰিত কৰি ভেকুৱাম চেণ্ট্ৰিফিউজত শুকুৱাই লওক।
এল চি-এম এছ/এম এছ বিশ্লেষণ। গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ বাবে পেপটাইড (সংখ্যা r119.aq) 25 চে.মি., 75 μm ভিতৰৰ ব্যাসৰ PicoFrit বিশ্লেষণাত্মক স্তম্ভ (নতুন উদ্দেশ্য লেন্স, অংশ সংখ্যা PF7508250) 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ মাধ্যম (Dr. Maisch, mat) সহ সজ্জিত, EASY-nLC ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল পৃথক কৰা হৈছিল ১২০০ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, জাৰ্মানী)। স্তম্ভটো ৫০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰখা হৈছিল। বাফাৰ A আৰু B ক্ৰমে পানীত ০.১% ফৰ্মিক এচিড আৰু ৮০% ACN ত ০.১% ফৰ্মিক এচিড। পেপটাইডসমূহ ৬%ৰ পৰা ৩১% বাফাৰ বিলৈ ৬৫ মিনিট আৰু ৩১%ৰ পৰা ৫০% বাফাৰ বিলৈ ৫ মিনিটৰ বাবে ২০০ এন এল/মিনিট গ্ৰেডিয়েণ্টেৰে পৃথক কৰা হৈছিল। এলুট কৰা পেপটাইডবোৰ অৰ্বিট্ৰেপ ফিউজন মাছ স্পেকট্ৰ’মিটাৰ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ত বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। পেপটাইড প্ৰিকাৰচাৰ m/z জোখ ৩৫০ৰ পৰা ১৫০০ m/z ৰ ভিতৰত ১,২০,০০০ ৰিজ’লিউচনৰ সৈতে কৰা হয়। ২৭% স্বাভাৱিক সংঘৰ্ষ শক্তি ব্যৱহাৰ কৰি ২ৰ পৰা ৬ আধান অৱস্থাৰ আটাইতকৈ শক্তিশালী পূৰ্বসূৰীক উচ্চ শক্তিৰ C ফান্দ বিচ্ছেদ (HCD) বিভাজনৰ বাবে নিৰ্বাচিত কৰা হয়। চক্ৰৰ সময় ১ ছেকেণ্ডত নিৰ্ধাৰণ কৰা হৈছে। পেপটাইড খণ্ডটোৰ m/z মান আয়ন ফান্দত জুখিছিল আটাইতকৈ সৰু AGC লক্ষ্য ৫×১০৪ আৰু সৰ্বোচ্চ বেজীৰ সময় ৮৬ মিনিট ব্যৱহাৰ কৰি। খণ্ডিত হোৱাৰ পিছত পূৰ্বসূৰীটোক ৪৫ ছেকেণ্ডৰ বাবে গতিশীল বৰ্জন তালিকাত ৰখা হৈছিল। টিএমটি-লেবেলযুক্ত পেপটাইডসমূহক ৫০ চে.মি., ৭৫ মাইক্ৰ’মিটাৰ এক্লেইম পেপমেপ কলাম (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, কেটেলগ নম্বৰ ১৬৪৯৪২)ত পৃথক কৰা হৈছিল আৰু প্ৰব্ৰজন বৰ্ণালীসমূহ উচ্চ-ক্ষেত্ৰৰ অসমতাপূৰ্ণ তৰংগ আকৃতি আয়ন (এফএআইএমএছ) সঁজুলিৰে সজ্জিত অৰ্বিট্ৰেপ লুমছ ট্ৰাইব্ৰিড গণ বৰ্ণালীমাপক (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক)ত বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক) −৫০ আৰু −৭০ ভিৰ দুটা ক্ষতিপূৰণ ভল্টেজত কাম কৰে। সমন্বয় পূৰ্বসূৰীৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি নিৰ্বাচিত MS3 টিএমটি প্ৰতিবেদন আয়ন সংকেত জোখাৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয়। পেপটাইড পৃথকীকৰণ EASY-nLC 1200 ত 90% ৰৈখিক গ্ৰেডিয়েণ্ট এলুচন ব্যৱহাৰ কৰি 6%ৰ পৰা 31% বাফাৰ ঘনত্বৰ সৈতে কৰা হৈছিল; বাফাৰ A আছিল ০.১% FA, আৰু বাফাৰ B আছিল ০.১% FA আৰু ৮০% ACN। বিশ্লেষণাত্মক স্তম্ভটো ৫০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত চলোৱা হয়। FAIMS ক্ষতিপূৰণ ভল্টেজ অনুসৰি মূল ফাইলটো বিভাজিত কৰিবলে FreeStyle (সংস্কৰণ 1.6, Thermo Fisher Scientific) ব্যৱহাৰ কৰক।
প্ৰটিন চিনাক্তকৰণ আৰু পৰিমাণ নিৰ্ণয়। সংহত এণ্ড্ৰমেডা চাৰ্চ ইঞ্জিন ব্যৱহাৰ কৰি মূল তথ্যসমূহ MaxQuant সংস্কৰণ ১.৫.২.৮ (https://maxquant.org/) ব্যৱহাৰ কৰি বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। Aequorea victoria ৰ পৰা পোৱা Cre recombinase আৰু YFP ক্ৰমৰ উপৰিও, পেপটাইড খণ্ড বৰ্ণালীত মাউছ ৰেফাৰেন্স প্ৰটিঅ'মৰ কেন'নিক ক্ৰম আৰু আইছ'ফৰ্ম ক্ৰমৰ সন্ধান কৰা হৈছিল (Proteome ID UP000000589, মে' ২০১৭ চনত UniProt ৰ পৰা ডাউনলোড কৰা)। মিথিঅ'নিন অক্সিডেচন আৰু প্ৰটিন এন-টাৰ্মিনেল এচিটাইলেচনক পৰিৱৰ্তনশীল পৰিৱৰ্তন হিচাপে নিৰ্ধাৰণ কৰা হৈছিল; চিষ্টাইন কাৰ্বাম'ইল মিথাইলেচনক নিৰ্দিষ্ট পৰিৱৰ্তন হিচাপে নিৰ্ধাৰণ কৰা হৈছিল। পাচনৰ পৰিমাপসমূহ “নিৰ্দিষ্টতা” আৰু “ট্ৰিপচিন/পি” হিচাপে ছেট কৰা হয়। প্ৰটিন চিনাক্তকৰণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা পেপটাইড আৰু ৰেজাৰ পেপটাইডৰ নূন্যতম সংখ্যা ১; পেপটাইড মেপ মিলনৰ চৰ্তত প্ৰটিন চিনাক্তকৰণৰ হাৰ আছিল ০.০১। “Second Peptide” বিকল্পটো সক্ৰিয় কৰা হৈছে। বিভিন্ন মূল ফাইলসমূহৰ মাজত সফল চিনাক্তকৰণসমূহ স্থানান্তৰ কৰিবলে “match between runs” বিকল্প ব্যৱহাৰ কৰক। লেবেল-মুক্ত পৰিমাণ নিৰ্ণয় (LFQ) (60)ৰ বাবে LFQ নূন্যতম অনুপাত গণনা 1 ব্যৱহাৰ কৰক। LFQ তীব্ৰতাক প্ৰতিটো সময়ত অন্ততঃ এটা জিন প্ৰকাৰ গোটত অন্ততঃ দুটা বৈধ মানৰ বাবে ফিল্টাৰ কৰা হয়, আৰু ৰ প্ৰস্থৰ সৈতে এটা স্বাভাৱিক বিতৰণৰ পৰা বহিৰ্প্ৰকাশ কৰা হয়। ০.৩ আৰু তললৈ ১.৮। LFQ ফলাফল বিশ্লেষণ কৰিবলৈ Perseus কম্পিউটিং প্লেটফৰ্ম (https://maxquant.net/perseus/) আৰু R (https://r-project.org/) ব্যৱহাৰ কৰক। লিমা চফট্ ৱেৰ পেকেজৰ পৰা এটা দুমুখীয়া মধ্যমীয়া t পৰীক্ষা ডিফাৰেন্সিয়েল এক্সপ্ৰেচন বিশ্লেষণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল (61)। ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally আৰু pheatmap ব্যৱহাৰ কৰি অন্বেষণমূলক তথ্য বিশ্লেষণ কৰা হয়। টিএমটি-ভিত্তিক প্ৰটিঅ'মিক্স তথ্যসমূহ মেক্সকুৱেণ্ট সংস্কৰণ ১.৬.১০.৪৩ ব্যৱহাৰ কৰি বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। ২০১৮ চনৰ ছেপ্টেম্বৰ মাহত ডাউনলোড কৰা ইউনিপ্ৰ’টৰ মানৱ প্ৰটিঅ’মিক্স ডাটাবেছৰ পৰা কেঁচা প্ৰটিঅ’মিক্স তথ্য সন্ধান কৰক।বিশ্লেষণত প্ৰস্তুতকাৰীয়ে প্ৰদান কৰা আইছ’ট’প বিশুদ্ধতা সংশোধন কাৰক অন্তৰ্ভুক্ত কৰা হৈছে। ভিন্নতামূলক প্ৰকাশ বিশ্লেষণৰ বাবে R ত লিমা ব্যৱহাৰ কৰক। মূল তথ্য, ডাটাবেইচ সন্ধান ফলাফল, আৰু তথ্য বিশ্লেষণ কাৰ্য্যপ্ৰবাহ আৰু ফলাফলসমূহ সকলো তথ্য ছেট চিনাক্তকৰ্তা PXD019690 ৰ সৈতে PRIDE অংশীদাৰ ভঁৰালৰ যোগেদি ProteomeXchange মিত্ৰতাত সংৰক্ষণ কৰা হয়।
কাৰ্য্যকৰী টীকাকৰণে বিশ্লেষণক সমৃদ্ধ কৰে। ৮ সপ্তাহত তথ্যৰ গোটৰ কাৰ্য্যকৰী টীকাকৰণ পদৰ সমৃদ্ধি নিৰ্ণয় কৰিবলৈ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) সঁজুলি ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল (চিত্ৰ ১)। মুঠতে LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) তথ্য বিশ্লেষণৰ পৰা পোৱা পৰিমাণগত প্ৰটিন তালিকাখন তলত দিয়া ফিল্টাৰ মাপকাঠীসমূহৰ সৈতে ব্যৱহাৰ কৰা হয়: Mus musculus ক প্ৰজাতি আৰু পটভূমি হিচাপে নিৰ্বাচিত কৰা হয়, আৰু শ্ৰেণীটোৱে দেখুৱাইছে যে বেঞ্জামিনিয়ে 0.05 বা তাতকৈ কম সমৃদ্ধিৰ বাবে সামঞ্জস্য কৰা P মানক উল্লেখযোগ্য বুলি বিবেচিত কৰা হৈছে। এই গ্ৰাফৰ বাবে, সমন্বিত P মানৰ ওপৰত ভিত্তি কৰি প্ৰতিটো থুপত শীৰ্ষ পাঁচটা অতিৰিক্ত শ্ৰেণী দেখুওৱা হৈছে। বেঞ্জামিনি, ক্ৰীগাৰ আৰু য়েকুটিয়েলিৰ দুটা পৰ্যায়ৰ ৰৈখিক বুষ্ট প্ৰগ্ৰেম ব্যৱহাৰ কৰি (Q = 5%) একাধিক টি-টেষ্ট ব্যৱহাৰ কৰি, প্ৰতিটো শ্ৰেণীত চিনাক্ত কৰা গুৰুত্বপূৰ্ণ প্ৰাৰ্থীসকলৰ ওপৰত সময়-পাঠ্যক্ৰম প্ৰটিন প্ৰকাশ বিশ্লেষণ কৰা হয়, আৰু প্ৰতিটো শাৰী পৃথকে পৃথকে বিশ্লেষণ কৰা হয়। সামঞ্জস্যপূৰ্ণ এছ ডি গ্ৰহণ কৰাৰ প্ৰয়োজন নাই।
এই অধ্যয়নৰ ফলাফল প্ৰকাশিত ডাটাবেছৰ সৈতে তুলনা কৰিবলৈ আৰু চিত্ৰ 1 ত এটা Venn ডায়াগ্ৰাম সৃষ্টি কৰিবলৈ, আমি MitoCarta 2.0 টীকা (24) ৰ সৈতে পৰিমাণগত প্ৰটিন তালিকা সংযুক্ত কৰিলোঁ। ডায়াগ্ৰাম সৃষ্টি কৰিবলৈ অনলাইন সঁজুলি Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) ব্যৱহাৰ কৰক।
প্ৰটিঅ'মিক্স বিশ্লেষণৰ বাবে ব্যৱহৃত পৰিসংখ্যাগত পদ্ধতিৰ বিষয়ে বিতং তথ্যৰ বাবে অনুগ্ৰহ কৰি সামগ্ৰী আৰু পদ্ধতিৰ সংশ্লিষ্ট অংশ চাওক। আন সকলো পৰীক্ষাৰ বাবে বিতং তথ্য সংশ্লিষ্ট কিংবদন্তিটোত পোৱা যাব। অন্যথা নিৰ্দিষ্ট নকৰালৈকে, সকলো তথ্য গড় ± SEM হিচাপে প্ৰকাশ কৰা হয়, আৰু সকলো পৰিসংখ্যা বিশ্লেষণ GraphPad Prism 8.1.2 চফ্টৱেৰ ব্যৱহাৰ কৰি কৰা হৈছিল।
এই প্ৰবন্ধটোৰ বাবে পৰিপূৰক সামগ্ৰীৰ বাবে, অনুগ্ৰহ কৰি http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 চাওক
এইটো ক্ৰিয়েটিভ কমন্স এট্ৰিবিউচন-নন-কমাৰ্চিয়েল লাইচেন্সৰ চৰ্ত অনুসৰি বিতৰণ কৰা এটা মুক্ত প্ৰৱেশৰ প্ৰবন্ধ, যিয়ে যিকোনো মাধ্যমত ব্যৱহাৰ, বিতৰণ আৰু প্ৰজনন কৰাৰ অনুমতি দিয়ে, যেতিয়ালৈকে চূড়ান্ত ব্যৱহাৰ বাণিজ্যিক লাভৰ বাবে নহয় আৰু ভিত্তিটো হ'ল যে মূল কামটো শুদ্ধ। সন্দৰ্ভ।
টোকা: আমি আপোনাক কেৱল আপোনাৰ ইমেইল ঠিকনা দিবলৈ কওঁ যাতে আপুনি পৃষ্ঠালৈ পৰামৰ্শ দিয়া ব্যক্তিজনে জানে যে আপুনি তেওঁলোকে ইমেইলটো চাব বিচাৰে আৰু ই স্পেম নহয়। আমি কোনো ইমেইল ঠিকনা ধৰিব নোৱাৰো।
এই প্ৰশ্নটো আপুনি দৰ্শক নেকি পৰীক্ষা কৰিবলৈ আৰু স্বয়ংক্ৰিয় স্পেম জমা দিয়া ৰোধ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
ই মটৰি, আই আটানাছভ, এছ এম ভি কোচান, কে ফ’লজ-ড’নাহুৱে, ভি সাকথিভেলু, পি জিয়াভালিস্কো, এন টনি, জে পুয়াল, এন-জি. লাৰ্ছন
অকাৰ্যকৰী নিউৰনৰ প্ৰটিঅ’মিক্স বিশ্লেষণে প্ৰকাশ কৰে যে স্নায়ুৰ অৱক্ষয় প্ৰতিহত কৰিবলৈ বিপাকীয় কাৰ্যসূচী সক্ৰিয় কৰা হয়।
ই মটৰি, আই আটানাছভ, এছ এম ভি কোচান, কে ফ’লজ-ড’নাহুৱে, ভি সাকথিভেলু, পি জিয়াভালিস্কো, এন টনি, জে পুয়াল, এন-জি. লাৰ্ছন
অকাৰ্যকৰী নিউৰনৰ প্ৰটিঅ’মিক্স বিশ্লেষণে প্ৰকাশ কৰে যে স্নায়ুৰ অৱক্ষয় প্ৰতিহত কৰিবলৈ বিপাকীয় কাৰ্যসূচী সক্ৰিয় কৰা হয়।
©২০২০ আমেৰিকান এছ'চিয়েচন ফৰ দ্য এডভান্সমেণ্ট অৱ চাইন্স। সকলো অধিকাৰ সংৰক্ষিত। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef আৰু COUNTER ৰ অংশীদাৰ। চাইন্সএডভান্সছ আই এছ এছ এন ২৩৭৫-২৫৪৮।