বৰ্তমান†বৰ্তমানৰ ঠিকনা: OX11 0DE, ইউ কে, ডাইমণ্ড বিল্ডিং, হাৰৱেল চাইন্স এণ্ড ইনোভেচন পাৰ্ক, ডায়েটকট, অক্সফৰ্ডশ্বাইৰ, ইউ কে, ডাইমণ্ড লাইট ছ'ৰ্চ কোম্পানী, লিমিটেড, ইলেক্ট্ৰনিক বায়'লজিকেল ইমেজিং চেণ্টাৰ।
বিক্ৰিয়া কেন্দ্ৰ পোহৰ সংগ্ৰহ কমপ্লেক্স ১ (RC-LH1) বেঙুনীয়া ৰঙৰ ফটোট্ৰফিক বেক্টেৰিয়াৰ মূল সালোক সংশ্লেষণ উপাদান। আমি Rhodopseudomonas palustris ৰ পৰা RC-LH1 কমপ্লেক্সৰ দুটা ক্ৰাইঅ’-ইলেক্ট্ৰন মাইক্ৰস্কোপি গঠন প্ৰৱৰ্তন কৰিলোঁ। RC-LH114-W কমপ্লেক্সৰ ২.৬৫-Å ৰিজ’লিউচন গঠনত RCক আগুৰি থকা ১৪টা উপ-ইউনিট LH1 লুপ থাকে, যিটো প্ৰটিন W দ্বাৰা বাধাপ্ৰাপ্ত হয়, আনহাতে প্ৰটিন-W নথকা কমপ্লেক্সটো RC দ্বাৰা আগুৰি থকা সম্পূৰ্ণৰূপে RC গঠন। বন্ধ ১৬ উপ-ইউনিট LH1 লুপ। এই গঠনসমূহৰ তুলনাই আৰ চি-এলএইচ১ কমপ্লেক্সত কুইননৰ গতিশীলতাৰ বিষয়ে অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে, য'ত আৰ চি কিউবি স্থানত কুইনন বান্ধিলে পূৰ্বতে অনিৰ্দিষ্ট কনফৰ্মেচনেল পৰিৱৰ্তন, লগতে সহায়ক কুইনন বান্ধনি স্থানৰ অৱস্থান, যিয়ে ইয়াক আৰ চিলৈ প্ৰেৰণ কৰাত সহায় কৰে। W প্ৰটিনৰ অনন্য গঠনে LH1 লুপ বন্ধ হোৱাত বাধা দিয়ে, যাৰ ফলত কুইনন/কুইনোলন বিনিময় ত্বৰান্বিত কৰাৰ বাবে এটা চেনেল সৃষ্টি হয়।
সালোক সংশ্লেষণৰ দ্বাৰা প্ৰদান কৰা শক্তিয়ে পৃথিৱীৰ প্ৰায় সকলো জীৱক টিকিয়াই ৰাখিব পাৰে, আৰু ইয়াৰ সৌৰ জৈৱ প্ৰযুক্তিৰ বাবে যথেষ্ট সম্ভাৱনা আছে। বিশ্বব্যাপী সালোক সংশ্লেষণক প্ৰসাৰিত কৰাৰ লগতে বেঙুনীয়া ৰঙৰ ফটোট্ৰফিক বেক্টেৰিয়াই বিভিন্ন শক্তিৰ ধৰণ আৰু বিপাকীয় ক্ষমতাও প্ৰদৰ্শন কৰে। ইহঁতে সালোক সংশ্লেষণ এৰাই চলি আন্ধাৰত হেটেৰ’ট্ৰফিক বেক্টেৰিয়া হিচাপে বৃদ্ধি পাব পাৰে, নাইট্ৰ’জেন আৰু কাৰ্বন ডাই অক্সাইড স্থাপন কৰিব পাৰে, হাইড্ৰ’জেন উৎপন্ন কৰিব পাৰে আৰু সুগন্ধি যৌগসমূহৰ অৱক্ষয় কৰিব পাৰে (১-৩)। এই প্ৰক্ৰিয়াসমূহৰ বাবে শক্তি প্ৰদান কৰিবলৈ হ’লে পোহৰক দ্ৰুত আৰু কাৰ্যক্ষমভাৱে ৰাসায়নিক শক্তিলৈ ৰূপান্তৰিত কৰিব লাগিব। এই প্ৰক্ৰিয়া আৰম্ভ হয় যেতিয়া পোহৰ আৱদ্ধ কৰা এন্টেনা কমপ্লেক্সে পোহৰ শোষণ কৰে আৰু আৱদ্ধ শক্তিক বিক্ৰিয়া কেন্দ্ৰলৈ (RC) স্থানান্তৰ কৰে, যাৰ ফলত আধান পৃথকীকৰণ আৰম্ভ হয় (4 – 7)। বেঙুনীয়া ৰঙৰ ফটোট্ৰফিক বেক্টেৰিয়াত সালোক সংশ্লেষণৰ মূল এককটো টাইপ ২ আৰ চিৰে গঠিত, যিটো পোহৰ সংগ্ৰহ কৰা কমপ্লেক্স ১ (LH1) দ্বাৰা আগুৰি থাকে, যিয়ে আৰ চি-এলএইচ১ কোৰ কমপ্লেক্স গঠন কৰে। LH1 বক্ৰ αβ হেটেৰ'ডাইমাৰৰ এটা এৰে দ্বাৰা গঠিত, যাৰ প্ৰত্যেকেই দুটা বেক্টেৰিয়াৰ ক্ল'ৰ'ফিল (BChl) a অণু আৰু এটা বা দুটা কেৰটিন'ইড বান্ধি ৰাখে (8-12)। সৰলতম LH1 এন্টেনা বন্ধ লুপত RC (9-13) আগুৰি থকা 16 বা 17 αβ heterodimers দ্বাৰা গঠিত, কিন্তু অন্যান্য কোৰ কমপ্লেক্সত, ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন পেপটাইডে চাৰিওফালৰ LH1 ৰ ধাৰাবাহিকতাক বাধা দিয়ে, যাৰ ফলত RC আৰু cytochrome bc1 কমপ্লেক্সৰ মাজত quinol/quinone প্ৰসাৰণ প্ৰসাৰিত হয় (11, ১৩-১৫)। বেঙুনীয়া ৰঙৰ ফটোট্ৰফিক উদ্ভিদ Rhodopseudomonas (Rps.) হৈছে সালোক সংশ্লেষণক সমৰ্থন কৰা শক্তি আৰু ইলেক্ট্ৰন স্থানান্তৰ বুজিব পৰা এটা আৰ্হি জীৱ। Rps ৰ প্ৰথম স্ফটিক গঠন। পেলুষ্ট্ৰিছ আৰ চি-এল এইচ ১ কমপ্লেক্সৰ মডেলটো হৈছে আৰ চি, ইয়াৰ চাৰিওফালে ১৫টা হেটেৰ’ডাইমেৰিক এল এইচ ১ লুপ থাকে, যিবোৰ “প্ৰটিন ডব্লিউ” নামৰ এটা অজ্ঞাত প্ৰ’টিনৰ দ্বাৰা বাধাপ্ৰাপ্ত হয় (১৪)। তাৰ পিছত প্ৰটিন-ডব্লিউক RPA4402 হিচাপে চিনাক্ত কৰা হয়, যিটো তিনিটা ভৱিষ্যদ্বাণী কৰা ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন হেলিচ (TMH) (16) থকা এটা অবৈশিষ্ট্যহীন 10.5kDa প্ৰটিন। আমি RC-L, M (pufL, pufM) আৰু LH1α, β (pufA, pufB) উপ-ইউনিট সংকেত কৰা জিনৰ বাবে ব্যৱহৃত নামকৰণৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণ হ’বলৈ প্ৰটিন W সংকেত কৰা rpa4402 জিনক pufW লৈ পুনৰ নামকৰণ কৰাৰ প্ৰস্তাৱ দিছো। আমোদজনকভাৱে, প্ৰটিন-W মাত্ৰ প্ৰায় ১০% RC-LH1 তহে থাকে, যাৰ ফলত Rps প্ৰকাশ পায়। palustris এ দুটা ভিন্ন RC-LH1 কমপ্লেক্স উৎপন্ন কৰে। ইয়াত আমি দুটা কোৰ কমপ্লেক্সৰ উচ্চ-ৰিজ’লিউচন ক্ৰাইঅ’-ইএম (ক্ৰাইঅ’-ইএম) গঠনৰ ৰিপ’ৰ্ট কৰিছো, এটাত প্ৰ’টিন ডব্লিউ আৰু ১৪টা αβ হেটেৰ’ডাইমাৰ, আনটোত প্ৰ’টিন ডব্লিউ আৰু বন্ধ ১৬টা হেটেৰ’ডাইমাৰ এলএইচ১ লুপ। আমাৰ গঠনে Rps ৰ RC-LH1 কমপ্লেক্সৰ বুজাবুজিৰ এক পদক্ষেপ পৰিৱৰ্তনক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। palustris, কাৰণ আমি প্ৰতিটো ভিন্নতাৰ সমজাতীয় জনসংখ্যা বিশ্লেষণ কৰিছো আৰু প্ৰতিটো পেপটাইড আৰু বান্ধি ৰখা ৰং আৰু আনুষংগিক লিপিড আৰু কুইনন স্পষ্টভাৱে নিযুক্ত কৰিবলৈ যথেষ্ট ৰিজ'লিউচন আছে। এই গঠনসমূহৰ তুলনা কৰিলে দেখা যায় যে এতিয়ালৈকে আন কোনো আৰ চি-এলএইচ১ কমপ্লেক্সত পোৱা নগ’ল তিনিটা টিএমএইচ প্ৰ’টিন-ডব্লিউৱে কুইনন/কুইনোলন বিনিময় ত্বৰান্বিত কৰিবলৈ কুইনন চ্যানেল সৃষ্টি কৰে। কেইবাটাও সংৰক্ষিত লিপিড আৰু কুইনন বান্ধনি স্থান চিনাক্ত কৰা হৈছে, আৰু আমি কুইনন আৰু আৰ চিৰ সংমিশ্ৰণৰ পিছত এক নতুন ৰূপান্তৰ পৰিৱৰ্তন উন্মোচন কৰিছো, যিটো অক্সিজেনযুক্ত ফটোট্ৰফিক জীৱৰ ফটোচিষ্টেম II (PSII) আৰ চিৰ বাবে উপযোগী হ'ব পাৰে। আমাৰ তথ্যই বেঙুনীয়া ৰঙৰ ফটোট্ৰফিক বেক্টেৰিয়াৰ RC-LH1 কোৰ কমপ্লেক্সত কুইনন/কুইনোলন বান্ধনি আৰু বিনিময়ৰ গতিবিদ্যাৰ বিষয়ে নতুন অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে।
Rps ত পোৱা দুটা কমপ্লেক্সৰ বিশদ অধ্যয়নৰ সুবিধাৰ বাবে। palustris, আমি জৈৱৰাসায়নিক পদ্ধতিৰে প্ৰতিটো RC-LH1 পৃথক কৰো। প্ৰটিন W-অভাৱী কমপ্লেক্স (ইয়াৰ পিছত ΔpufW বুলি কোৱা হ'ব) pufW জিন (16) নথকা ষ্ট্ৰেইনৰ পৰা বিশুদ্ধ কৰা হৈছিল, আৰু মাত্ৰ এটা RC-LH1 কমপ্লেক্স উৎপাদন কৰিব পৰা গৈছিল। প্ৰটিন W যুক্ত কমপ্লেক্সটো এটা ষ্ট্ৰেইনৰ দ্বাৰা উৎপন্ন হয়। এই ষ্ট্ৰেইনৰ প্ৰটিন W ইয়াৰ C-টাৰ্মিনাছত 10x His টেগৰ সৈতে সংশোধন কৰা হয়, যাতে প্ৰটিন W যুক্ত কমপ্লেক্সটোক ধাতুক স্থিৰ কৰি বেছিভাগ অভাৱী প্ৰটিন Wৰ সৈতে ফলপ্ৰসূভাৱে সংযুক্ত কৰিব পাৰি। কমপ্লেক্সটো ফলপ্ৰসূভাৱে পৃথক কৰা হয় (১৬) এফিনিটি ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফী (IMAC)।
চিত্ৰ ১ত দেখুওৱাৰ দৰে দুয়োটা কমপ্লেক্সতে এটা LH1 এন্টেনাৰে আগুৰি থকা তিনিটা উপ-ইউনিট RC (RC-L, RC-M আৰু RC-H) থাকে। প্ৰটিন-ডব্লিউৰ অভাৱত থকা কমপ্লেক্সটোৰ ২.৮০-এ গঠনত ১৬টা αβ হেটেৰ’ডাইমাৰ দেখা যায়, যিয়ে RCক সম্পূৰ্ণৰূপে আগুৰি থকা এটা বন্ধ LH1 লুপ গঠন কৰে, যাক ইয়াৰ পিছত RC-LH116 কমপ্লেক্স বুলি কোৱা হ’ব। প্ৰটিন-W যুক্ত কমপ্লেক্সৰ ২.৬৫Å গঠনত প্ৰটিন-ডব্লিউৰ দ্বাৰা বাধাপ্ৰাপ্ত ১৪-হেটেৰ’ডাইমাৰ LH1 থাকে, ইয়াক ইয়াৰ পিছত RC-LH114-W বুলি কোৱা হ’ব।
(A আৰু B) যৌগটোৰ পৃষ্ঠৰ উপস্থাপন। (C আৰু D) ৰডত প্ৰকাশ কৰা বন্ধনযুক্ত ৰঞ্জক পদাৰ্থ। (E আৰু F) চাইট'প্লাজমিক পৃষ্ঠৰ পৰা পৰ্যবেক্ষণ কৰা কমপ্লেক্সসমূহৰ পেপটাইড আৰু LH1 উপ-ইউনিটসমূহ কাৰ্টুনত প্ৰতিনিধিত্ব কৰা হয়, আৰু প্ৰটিন-W ফাঁকৰ পৰা ঘড়ীৰ কাঁটাৰ দিশত সংখ্যা দিয়া হয় [Rba সংখ্যাকৰণৰ সৈতে সামঞ্জস্যপূৰ্ণ। স্ফেৰ'ইডছ কমপ্লেক্স (13)]। LH1-α ৰ বাবে প্ৰটিন উপ-ইউনিটৰ ৰং হালধীয়া; LH1-βৰ বাবে প্ৰটিন উপ-ইউনিটৰ ৰং নীলা; প্ৰটিন-ডব্লিউৰ বাবে প্ৰটিনটো ৰঙা; আৰ চি-এইচৰ বাবে ই চাইয়ান; আৰ চি-এলৰ বাবে ই কমলা; আৰ চি-এমৰ বাবে, মেজেন্টা। কোফেক্টৰক ৰডৰ দ্বাৰা প্ৰতিনিধিত্ব কৰা হয়, সেউজীয়া ৰঙে BChl আৰু BPh a অণুক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে, বেঙুনীয়া ৰঙে কেৰটিনয়ডক আৰু হালধীয়া ৰঙে UQ10 অণুক প্ৰতিনিধিত্ব কৰে। (G আৰু H) RC-LH114-W কমপ্লেক্স (G) আৰু RC-LH116 কমপ্লেক্স (H)ৰ সমতুল্য অঞ্চলত থকা প্ৰটিন-W ব্যৱধানৰ বৃদ্ধি কৰা দৃশ্য। কোফেক্টৰসমূহ স্থান ভৰোৱাৰ ৰূপত প্ৰদৰ্শিত হয়, চিলেটেড কুইনন নীলা ৰঙত প্ৰদৰ্শিত হয়। প্ৰটিন-W ব্যৱধান (G) ত নীলা ডেছ ৰেখাৰে উজ্জ্বল কৰা হৈছে, আৰু LH116 আঙঠিত কুইনন/কুইনলল বিয়পি পৰা সৰু ফুটাবোৰ (H) ত ক'লা ডেছ ৰেখাৰে উজ্জ্বল কৰা হৈছে।
চিত্ৰ ১ (A আৰু B)ত LH1αβ হেটেৰ'ডাইমাৰৰ মুকলি বা বন্ধ এৰেৰে আগুৰি থকা RC দেখুওৱা হৈছে, যাৰ প্ৰত্যেকেই দুটা BChl আৰু এটা কেৰটিন'ইড বান্ধি ৰাখে (চিত্ৰ ১, C আৰু D)। পূৰ্বৰ গৱেষণাৰ পৰা দেখা গৈছে যে Rps হৈছে LH1 কমপ্লেক্স। স্পাইৰুলিনা জেনথিনৰ জৈৱসংশ্লেষণ পথত এই প্ৰজাতিবোৰত কেৰটিনয়ডৰ মিশ্ৰিত জনসংখ্যা থাকে (১৭)। কিন্তু স্পাইৰ’পাইৰ’ক্সান্থিন প্ৰধান কেৰটিন’ইড আৰু ইয়াৰ ঘনত্ব সন্তোষজনক। গতিকে আমি সকলো LH1 বান্ধনি স্থানতে স্পাইৰ’ক্সান্থিনৰ মডেলিং কৰিবলৈ বাছি লৈছিলো। আলফা আৰু বিটা পলিপেপটাইড হৈছে চুটি মেমব্ৰেন বাহিৰৰ অঞ্চল থকা একক টিএমএইচ (চিত্ৰ ১, এ, বি, ই, আৰু এফ)। যদিও C-টাৰ্মিনাছত ১৭টা অৱশিষ্টৰ ঘনত্ব দেখা নগ’ল, আলফা পলিপেপটাইড দুয়োটা কমপ্লেক্সতে Met1ৰ পৰা Ala46লৈ বিভাজিত হৈছিল। β পলিপেপটাইড RC-LH116 ত Gly4 ৰ পৰা Tyr52 লৈ, আৰু RC-LH114-W ত Ser5 ৰ পৰা Tyr52 লৈ হ্ৰাস কৰা হৈছিল। 3 বা 4 টা N-টাৰ্মিনেল বা 13 টা C-টাৰ্মিনেল অৱশিষ্টৰ কোনো ঘনত্ব দেখা নগ'ল (চিত্ৰ S1)। বন্য-প্ৰকাৰৰ ষ্ট্ৰেইনৰ পৰা প্ৰস্তুত কৰা মিশ্ৰিত RC-LH1 কমপ্লেক্সৰ গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান বিশ্লেষণে দেখুৱাইছে যে হেৰাই যোৱা অঞ্চলটো এই পেপটাইডবোৰৰ বিষম বিভাজনৰ ফল (চিত্ৰ S1 আৰু S2)। α-Met1 ৰ N-টাৰ্মিনেল ফৰ্মাইলেচনো দেখা গৈছিল (f)। বিশ্লেষণত দেখা গ’ল যে α-পেপটাইডটো fMet1ৰ পৰা Asp42/Ala46/Ala47/Ala50লৈকে অৱশিষ্টৰে গঠিত, আৰু β-পেপটাইডটো Ser2ৰ পৰা Ala53লৈকে অৱশিষ্টৰে গঠিত, যিটো কম উষ্ণতাৰ ই এম ঘনত্বৰ মানচিত্ৰৰ সৈতে ভালদৰে মিল আছে।
α-His29 আৰু β-His36 ৰ সমন্বয়ে BChls সকলক মুখামুখি কৰি তোলে; প্ৰতিটো αβ হেটেৰ'ডাইমাৰে ইয়াৰ ওচৰ-চুবুৰীয়াৰ সৈতে একত্ৰিত হৈ আৰ চিৰ চাৰিওফালে এটা মুকলি লুপ (RC-LH114-W) বা এটা বন্ধ লুপ (RC-LH116) গঠন কৰে। RC-LH114-W ৰ 877 nm বেণ্ডৰ সৈতে তুলনা কৰিলে RC-LH116 ৰ 880 nm শোষণ ৰঙা পৰিৱৰ্তন ৩ nm (চিত্ৰ ২A)। কিন্তু বৃত্তাকাৰ ডাইক্ৰ’ইজম বৰ্ণালী প্ৰায় একেই (চিত্ৰ ২B), ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে যদিও মুকলি আৰু বন্ধ লুপৰ মাজত স্পষ্ট পাৰ্থক্য আছে, বিচিএইচএলৰ স্থানীয় পৰিৱেশ অতি মিল আছে। শোষণ ৰেডশ্বিফ্ট বন্ধ লুপত তাপীয় গতি হ্ৰাস আৰু স্থিৰতা বৃদ্ধিৰ ফল হ'ব পাৰে (18, 19), বন্ধ লুপৰ ফলত হোৱা ৰং সংযোজনৰ পৰিৱৰ্তন (20, 21), বা এই দুটা প্ৰভাৱৰ সংমিশ্ৰণ (11)।
(A) অতিবেঙুনীয়া/দৃশ্যমান/অতি ৰঙা শোষণ বৰ্ণালী, যাৰ শিখৰবোৰ নিজৰ সংশ্লিষ্ট ৰঞ্জক পদাৰ্থৰে চিহ্নিত কৰা হয় আৰু ৭৭৫ এন এমত BPh শিখৰলৈ স্বাভাৱিক কৰা হয়। (B) বৃত্তাকাৰ ডাইক্ৰ’ইজম বৰ্ণালী ৮০৫ এন এমত BChl শোষণলৈ স্বাভাৱিক কৰা। (C আৰু D) RC-LH114-W কমপ্লেক্স (C) আৰু RC-LH116 কমপ্লেক্স (D)ৰ সময়-সমাধান শোষণ বৰ্ণালীৰ পৰা নিৰ্বাচিত ΔA বৰ্ণালী। উন্নত তুলনাযোগ্যতাৰ বাবে সকলো বৰ্ণালীক ০.২ পি এছত −A ৰ ∆A লৈ স্বাভাৱিক কৰা হয়। (E) UQ2 ৰ বিভিন্ন ঘনত্বৰ উপস্থিতিত বিকিৰণৰ পিছত চাইট’ক্ৰ’ম c2 অক্সিডেচনৰ হাৰ (কেঁচা তথ্যৰ বাবে চিত্ৰ S8 চাওক)। (F) কম, মধ্যমীয়া বা উচ্চ তীব্ৰতাৰ পোহৰৰ অধীনত (ক্ৰমে ১০, ৩০ বা ৩০০μMm-2 s-1) বৃদ্ধি কৰা কোষত বিশুদ্ধ কমপ্লেক্সত প্ৰটিন W আৰু RC-L উপ-ইউনিট আৰু পৃথক কৰা পৰ্দাৰ অনুপাত। SDS-polyacrylamide gel electrophoresis আৰু immunoassay দ্বাৰা প্ৰটিনৰ মাত্ৰা নিৰ্ণয় কৰা (কেঁচা তথ্যৰ বাবে চিত্ৰ S9 চাওক)। বিশুদ্ধ RC-LH114-W কমপ্লেক্সৰ সাপেক্ষে অনুপাত নিৰ্ণয় কৰা। কমপ্লেক্সটোৰ RC-L আৰু প্ৰটিন-W ৰ ষ্ট’ইকিয়ামেট্ৰিক অনুপাত ১:১।
RC-LH114-W (চিত্ৰ 1, A, C, আৰু E) ৰ বিকৃত αβ14 লুপত 1 নং স্থানত থকা BChls RC-LH116 ৰ সমতুল্য BChls তকৈ 6.8Å RC প্ৰাথমিক দাতাৰ (P) ৰ ওচৰত (চিত্ৰ. 1, B, D, আৰু F, আৰু চিত্ৰ S3); কিন্তু দুয়োটা জটিলৰ ক্ষণস্থায়ী শোষণ গতিবিদ্যাই দেখুৱাইছে যে RC-LH114-W আৰু RC-LH116 ৰ বাবে LH1ৰ পৰা RC লৈ উত্তেজনা শক্তি স্থানান্তৰ সময়ৰ ধ্ৰুৱক 40 ±4 আৰু 44±3 ps (চিত্ৰ 2)। , C আৰু D, চিত্ৰ S4 আৰু সূচী S2)। আৰ চিৰ ভিতৰত ইলেক্ট্ৰনিক স্থানান্তৰৰ ক্ষেত্ৰতো কোনো বিশেষ পাৰ্থক্য দেখা নাযায় (চিত্ৰ S5 আৰু আনুষংগিক পৰিপূৰক পাঠ)। আমি সন্দেহ কৰোঁ যে LH1 আৰু RC-P ৰ মাজত শক্তি স্থানান্তৰ সময়ৰ ঘনিষ্ঠ মিলৰ কাৰণ হৈছে LH1 লুপ দুটাত থকা বেছিভাগ BChl ৰ একে দূৰত্ব, কোণ আৰু সম্ভাৱ্য শক্তি। এনে লাগে যে নূন্যতম দূৰত্বত উপনীত হ’বলৈ এল এইচ ১ শক্তিৰ আৰ্হিটো অন্বেষণ কৰাটো উপ-অনুকূল স্থানৰ পৰা আৰ চিলৈ প্ৰত্যক্ষ শক্তি স্থানান্তৰতকৈ দ্ৰুত নহয়। RC-LH114-W ত মুকলি-লুপ LH1 লুপটোৱেও গাঁথনিগত বিশ্লেষণৰ বাবে কম উষ্ণতাৰ পৰিস্থিতিত গুৰুত্বহীন তাপীয় গতিৰ সন্মুখীন হ'ব পাৰে, আৰু RC 1 ৰ অৱস্থানত βBChls ৰ ৰং কৰা দূৰত্বৰ পৰা কোঠাৰ উষ্ণতাত দীঘলীয়া αβ14 আঙঠিৰ ৰূপান্তৰ থাকে।
আৰ চি-এলএইচ১১৬ কমপ্লেক্সত ৩২টা বিচিএইচ আৰু ১৬টা কেৰটিনয়ড থাকে আৰু ইয়াৰ সামগ্ৰিক ব্যৱস্থা থাৰ্মোক্ৰ’মেটিয়াম (Tch.) পিডপিডাম [প্ৰটিন ডাটা বেংক (পিডিবি) আইডি ৫ৱাই৫এছ] ​​(৯), থাইঅ’ৰ’ড’ভিব্ৰিয়া (Trv.) ৯৭০টা ষ্ট্ৰেইন ( পিডিবি আইডি ৭চি৯আৰ) (১২) আৰু সেউজীয়াৰ পৰা পোৱাৰ সৈতে একে শেলাই (Blc.viridis) (পিডিবি আইডি ৬ইটি৫) (১০)। প্ৰান্তিককৰণৰ পিছত αβ হেটেৰ’ডাইমাৰৰ অৱস্থানত মাত্ৰ সৰু সৰু বিচ্যুতি দেখা গৈছিল, বিশেষকৈ ১-৫, ১৫, আৰু ১৬ (চিত্ৰ S6)। প্ৰটিন-W ৰ উপস্থিতিয়ে LH1 ৰ গঠনত যথেষ্ট প্ৰভাৱ পেলায়। ইয়াৰ তিনিটা টিএমএইচ চুটি লুপৰ দ্বাৰা সংযুক্ত, কমপ্লেক্সৰ লুমেন ফালে N-টাৰ্মিনেল আৰু চাইট'প্লাজমিক ফালে C-টাৰ্মিনেল (চিত্ৰ ১A আৰু ৩, Aৰ পৰা Dলৈ)। প্ৰটিন-W বহুলাংশে হাইড্ৰ'ফ'বিক (চিত্ৰ ৩B), আৰু TMH2 আৰু TMH3 এ LH1αβ-14ৰ সৈতে ক্ৰিয়া কৰি এটা ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন পৃষ্ঠ গঠন কৰে (চিত্ৰ 3, B আৰু E ৰ পৰা G)। আন্তঃপৃষ্ঠটো মূলতঃ ট্ৰেন্সমেম্ব্ৰেন অঞ্চলত থকা Phe, Leu আৰু Val অৱশিষ্টৰে গঠিত। এই অৱশিষ্টবোৰ হাইড্ৰ’ফ’বিক এমিনো এচিড আৰু αβ-14 ৰঞ্জক পদাৰ্থৰে ষ্টেক কৰা হয়। কিছুমান মেৰু অৱশিষ্টইও পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়াৰ ক্ষেত্ৰত অৰিহণা যোগায়, য'ত জটিল গহ্বৰৰ পৃষ্ঠত W-Thr68 আৰু β-Trp42ৰ মাজৰ হাইড্ৰ'জেন বন্ধন অন্তৰ্ভুক্ত (চিত্ৰ ৩, F আৰু G)। চাইট’প্লাজমৰ পৃষ্ঠত Gln34 αβ-14 কেৰটিনয়ডৰ কিট’ গোটৰ কাষতে থাকে। ইয়াৰ উপৰিও n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) অণুটো সমাধান হৈছিল, আৰু ইয়াৰ হাইড্ৰ’ফ’বিক ঠেংখন প্ৰ’টিন-W আৰু αβ-14ৰ মাজৰ সংযোগস্থললৈকে বিস্তৃত হৈছিল আৰু লিপিড ঠেংটো শৰীৰত অৱস্থিত হ’ব পাৰে। আমি এইটোও লক্ষ্য কৰিলোঁ যে প্ৰটিন W আৰু RCH ৰ C-টাৰ্মিনেল ৰিজ’লিউচন অঞ্চল অতি ওচৰত, কিন্তু নিৰ্দিষ্ট পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া গঠনৰ পৰিসৰৰ ভিতৰত নহয় (চিত্ৰ ১, A আৰু E)। কিন্তু এই দুটা প্ৰটিনৰ অমীমাংসিত C-টাৰ্মিনেল এমিনো এচিডত পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া হ’ব পাৰে, যিয়ে RC-LH114-W কমপ্লেক্সৰ সমাবেশৰ সময়ত প্ৰটিন-W নিযুক্তিৰ বাবে এক ব্যৱস্থা প্ৰদান কৰিব পাৰে।
(A) কাৰ্টুন আকাৰত LH1αβ14ৰ সৈতে সংযোগস্থলৰ সন্মুখত থকা প্ৰটিন-W, ইয়াৰ এটা ৰড আকৃতিৰ কাষৰ শৃংখল (ৰঙা) থাকে, যিটো ইলেক্ট্ৰষ্টেটিক পটেনচিয়েল ডায়েগ্ৰামৰ এটা অংশত প্ৰদৰ্শিত হয় (০.১৩ কনট্যুৰ স্তৰৰ সৈতে স্বচ্ছ ধূসৰ পৃষ্ঠ)। (B) হাইড্ৰ’ফ’বিক ৰঙৰ পৃষ্ঠৰে প্ৰতিনিধিত্ব কৰা প্ৰটিন-W। মেৰু আৰু আধানযুক্ত অঞ্চলবোৰ চাইয়ান ৰঙেৰে প্ৰদৰ্শিত হয়, হাইড্ৰ'ফ'বিক অঞ্চলবোৰ বগা আৰু প্ৰবল হাইড্ৰ'ফ'বিক অঞ্চল কমলা ৰঙেৰে প্ৰদৰ্শিত হয়। (C আৰু D) কাৰ্টুনত প্ৰতিনিধিত্ব কৰা প্ৰটিন-W, ইয়াৰ দিশ (A) (C) ৰ দৰেই, আৰু ১৮০° (D) ঘূৰোৱা। ক্ৰমৰ অৱস্থান অনুসৰি পৃথক কৰিব পৰা অৱশিষ্টবোৰে ৰামধেনুৰ ৰঙৰ আঁচনি গ্ৰহণ কৰে, য’ত N-টাৰ্মিনেলটো নীলা আৰু C-টাৰ্মিনেলটো ৰঙা। (E) (A) ৰ দৰে একে দৃশ্যতে প্ৰটিন-W, আৰু প্ৰটিন-W:LH1 ৰ সংযোগস্থলত থকা অৱশিষ্টবোৰক সংলগ্ন চিহ্ন থকা ৰডৰ দ্বাৰা প্ৰতিনিধিত্ব কৰা হয়। (F) কাৰ্টুন উপস্থাপনত (E) আৰু LH1αβ14 ৰ তুলনাত প্ৰটিন-W 90° ঘূৰোৱা হয়, আৰু বাৰ উপস্থাপনত আন্তঃপৃষ্ঠৰ অৱশিষ্টৰ তুলনাত। বিটা পলিপেপটাইডৰ পৰা ওলমি থকা অৱশিষ্টবোৰ লেবেল কৰা হয়। কোফেক্টৰটোক চিত্ৰ ১ৰ ৰঙৰ সৈতে মিল থকা বাৰ হিচাপে দেখুওৱা হৈছে, পচি যোৱা β-DDM ধূসৰ ৰঙেৰে দেখুওৱা হৈছে আৰু অক্সিজেন ৰঙা ৰঙেৰে দেখুওৱা হৈছে। (G) (F) ত থকা দৃশ্যটো ১৮০° ঘূৰাই দিয়া হৈছে, য’ত লেবেলযুক্ত আলফা পলিপেপটাইডৰ বিশিষ্ট অৱশিষ্ট থাকে।
প্ৰটিন-W এ এটা αβ হেটেৰ'ডাইমাৰৰ ঠাই লয় (চিত্ৰ ১F ত ১৫ নং), যাৰ ফলত লুপ বন্ধ হোৱাত বাধা দিয়ে আৰু প্ৰথম তিনিটা αβ হেটেৰ'ডাইমাৰ হেলনীয়া হয়। দেখা গ’ল যে ফিল্ম স্বাভাৱিকৰ তুলনাত প্ৰথম αβ-1 হেটেৰ’ডাইমাৰৰ সৰ্বোচ্চ হেলনীয়া কোণ আছিল ২৫°ৰ পৰা ২৯° (চিত্ৰ ১, এ আৰু ই), যিটো আৰ চি এ চোকা কনট্ৰাষ্ট-এলএইচ১১৬ত αβ-১ৰ ২°ৰ পৰা ৮° হেলনীয়া হোৱাৰ ফলত গঠিত হৈছিল (চিত্ৰ ১, বি আৰু এফ)। দ্বিতীয় আৰু তৃতীয় হেটেৰ’ডাইমাৰ ক্ৰমে ১২°ৰ পৰা ২২° আৰু ৫°ৰ পৰা ১০° হেলনীয়া। RC ৰ ষ্টেৰিক বাধাৰ বাবে αβ-1 ৰ হেলনীয়া অংশত αβ ৰ দ্বিতীয় যোৰ অন্তৰ্ভুক্ত নহয় (যিটো চিত্ৰ 1F ৰ 16th αβ ৰ সৈতে মিল খায়), যাৰ ফলত LH1 আঙঠিত এটা স্পষ্ট ফাঁক গঠন হয় (চিত্ৰ 1, A আৰু E)। দুটা αβ হেটেৰ’ডাইমাৰৰ অভাৱৰ বাবে, চাৰিটা BChl আৰু দুটা কেৰটিন’ইডৰ ক্ষতিৰ বাবে, কোনো কেৰটিন’ইডে টুইষ্টেড αβ-1 উপ-ইউনিটৰ সৈতে বান্ধ খায়, যাৰ ফলত ১৩টা কেৰটিনয়ড নিৰামিষ আৰু ২৮টা BChl যুক্ত LH114-W আঙঠিৰ সৃষ্টি হয়। αβ1ৰ পৰা 7 অঞ্চলৰ দুটা কমপ্লেক্সৰ স্থানীয় ৰিজ'লিউচন অনুমান LH1 লুপৰ বাকী অংশতকৈ কম, যিয়ে RC QB স্থানৰ কাষৰ LH1 উপ-ইউনিটৰ অন্তৰ্নিহিত প্লাষ্টিচিটি প্ৰতিফলিত কৰিব পাৰে (চিত্ৰ 4)।
RC-LH114-W (A আৰু B) আৰু RC-LH116 (C আৰু D) ৰ ছবিসমূহ একেটা ওপৰৰ দৃশ্য/পক্ষৰ দৃশ্য (A আৰু B) (A আৰু C) আৰু চিত্ৰ 1. (B আৰু D) ৰ গহ্বৰৰ পৃষ্ঠৰ পৰা দেখুওৱা হৈছে। ৰঙীন চাবিবোৰ সোঁফালে দেখুওৱা হৈছে।
১:১৪ ষ্ট'ইকিয়ামেট্ৰিক অনুপাতৰ আন একমাত্ৰ বৈশিষ্ট্যপূৰ্ণ কোৰ কমপ্লেক্সটো হ'ল ৰ'ড'ককাছ স্ফেৰ'ইডছ (Rba.) RC-LH1-PufX ডাইমাৰ (১৩)। কিন্তু প্ৰটিন W আৰু PufX ৰ কোনো স্পষ্ট সমতা নাই, আৰু ইয়াৰ নিজ নিজ LH1 গঠনত যথেষ্ট প্ৰভাৱ পৰে। PufX হৈছে এটা N-টাৰ্মিনেল চাইট'প্লাজমিক ডমেইন থকা একক TMH যিয়ে Rps ৰ সৈতে সংগতি ৰাখি RC-H উপ-ইউনিটৰ চাইট'প্লাজমিক ফালৰ সৈতে (13) ক্ৰিয়া কৰে। পালুষ্ট্ৰিছ LH116αβ-16। PufX এ RC-LH1 আৰু চাইট'ক্ৰ'ম bcl কমপ্লেক্সৰ মাজত কুইনন/কুইনোলন বিনিময়ৰ বাবে এটা চেনেল সৃষ্টি কৰে আৰু সকলো Rba ত উপস্থিত থাকে। স্ফেৰ'ইডছ কোৰ কমপ্লেক্স (১৩)। যদিও মনোমাৰ-মনোমাৰ আন্তঃপৃষ্ঠ Rba ত আছে। স্ফেৰ’ইডছ RC-LH1-PufX ডাইমাৰ RC-LH114-W ত প্ৰটিন W ৰ বান্ধনি স্থানত অৱস্থিত, আৰু PufX আৰু প্ৰটিন-W ৰ দ্বাৰা প্ৰৰোচিত ব্যৱধান সমতুল্য স্থানত থাকে (চিত্ৰ S7A)। RC-LH114-W ৰ ফাঁকটো Pseudomonas rosea LH1 ৰ কাল্পনিক কুইনন চ্যানেল (8) ৰ সৈতেও প্ৰান্তিককৃত, যিটো প্ৰটিন W বা PufX ৰ সৈতে সম্পৰ্ক নোহোৱা পেপটাইডৰ দ্বাৰা গঠিত (চিত্ৰ S7B)। ইয়াৰ উপৰিও Blc ত quinone চেনেল। এটা γ উপ-ইউনিট (7) বাদ দি গঠিত পান্না সেউজীয়া LH1 একে অৱস্থাত অৱস্থিত (চিত্ৰ S7C)। যদিও বিভিন্ন প্ৰটিনৰ দ্বাৰা মধ্যস্থতা কৰা হয়, এই কুইনন/কুইনোলল চ্যানেলসমূহৰ RC-LH1 কমপ্লেক্সত সাধাৰণ স্থানত আবিৰ্ভাৱ হোৱাটো অভিসৰণ বিৱৰ্তনৰ উদাহৰণ যেন লাগে, ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে প্ৰটিন W দ্বাৰা সৃষ্টি হোৱা ব্যৱধানে কুইনন চ্যানেল হিচাপে কাম কৰিব পাৰে।
LH114-W লুপত থকা ফাঁকে প্ৰটিনৰ দৰে প্ৰটিন ছিদ্ৰৰ জৰিয়তে দুয়োটা ডমেইনক সংযোগ কৰাৰ পৰিৱৰ্তে RC-LH114-W কমপ্লেক্স আৰু বাল্ক মেমব্ৰেন (চিত্ৰ ১G)ৰ আভ্যন্তৰীণ স্থানৰ মাজত এটা অবিৰত মেমব্ৰেন অঞ্চল গঠনৰ অনুমতি দিয়ে। RC-LH116 কমপ্লেক্সটো বন্ধ Tch ৰ দৰেই। বেজীৰ দৰে জটিল (২২) (চিত্ৰ ১H)। যিহেতু মেমব্ৰেনৰ মাজেৰে কুইননৰ প্ৰসাৰণ সংকীৰ্ণ প্ৰটিন চেনেলৰ মাজেৰে হোৱা প্ৰসাৰণতকৈ বেছি দ্ৰুত, গতিকে মুকলি LH114-W লুপে বন্ধ LH116 লুপতকৈ দ্ৰুত RC টাৰ্ণঅভাৰৰ অনুমতি দিব পাৰে, আৰু RC লৈ কুইননৰ প্ৰসাৰণ অধিক সীমিত হ’ব পাৰে। প্ৰটিন W RC ৰ জৰিয়তে কুইননৰ ৰূপান্তৰত প্ৰভাৱ পেলায় নেকি পৰীক্ষা কৰিবলৈ আমি ইউবিকুইনন 2 (UQ2) (চুটি আইছ'প্ৰিন ঠেং থকা প্ৰাকৃতিক UQ10 ৰ এনালগ)ৰ এটা নিৰ্দিষ্ট ঘনত্বৰ ওপৰত চাইট'ক্ৰ'ম অক্সিডেচন পৰীক্ষা কৰিলোঁ (চিত্ৰ 2E)। যদিও চিলেটেড কুইননৰ উপস্থিতিয়ে আপাত মাইকেলিছ ধ্ৰুৱক সঠিক নিৰ্ণয় কৰাত বাধা দিয়ে (RC-LH114-W আৰু RC-LH116 ক্ৰমে 0.2±0.1μM আৰু 0.5±0.2μM ৰ বাবে উপযুক্ত), RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ৰ সৰ্বোচ্চ হাৰ RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1)তকৈ ২৮±৫% ডাঙৰ।
আমি প্ৰথমতে অনুমান কৰিছিলো যে প্ৰটিন-ডব্লিউ কোৰ কমপ্লেক্সৰ প্ৰায় ১০% ত উপস্থিত থাকে (১৬); ইয়াত কম পোহৰ, মধ্যম পোহৰ আৰু উচ্চ পোহৰৰ বৃদ্ধি কোষৰ দখলৰ হাৰ ক্ৰমে ১৫±০.৬%, ১১±১% আৰু ০.৯±০.৫ শতাংশ (চিত্ৰ ২F)। গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ পৰিমাণগত তুলনাই দেখুৱাইছে যে হিষ্টিডিন টেগ যোগ কৰিলে বন্য প্ৰজাতিৰ ষ্ট্ৰেইনৰ তুলনাত প্ৰটিন-ডব্লিউৰ আপেক্ষিক প্ৰাচুৰ্য্য হ্ৰাস পোৱা নাছিল (P = 0.59), গতিকে এই মাত্ৰাসমূহ পৰিৱৰ্তিত প্ৰটিন-ডব্লিউৰ কৃত্ৰিমতা নহয় (চিত্ৰ S10)। কিন্তু আৰ চি-এলএইচ১ কমপ্লেক্সত প্ৰটিন-ডব্লিউৰ এই কম দখলে কিছুমান আৰ চিক ত্বৰান্বিত হাৰত উলটিবলৈ অনুমতি দিব পাৰে, যাৰ ফলত আৰ চি-এলএইচ১১৬ কমপ্লেক্সত লেহেমীয়া কুইনন/কুইনোলন বিনিময় কম হয়। আমি লক্ষ্য কৰিলোঁ যে উচ্চ পোহৰ দখলৰ হাৰ শেহতীয়া ট্ৰেন্সক্ৰিপ্টমিক্স তথ্যৰ সৈতে অসঙ্গতিপূৰ্ণ, যিয়ে ইংগিত দিয়ে যে শক্তিশালী পোহৰৰ অধীনত pufW জিন প্ৰকাশ বৃদ্ধি পায় (চিত্ৰ S11) (23)। RC-LH1 কমপ্লেক্সত pufW ট্ৰান্সক্ৰিপচন আৰু প্ৰটিন-W অন্তৰ্ভুক্তিৰ মাজৰ পাৰ্থক্য বিভ্ৰান্তিকৰ আৰু ই প্ৰটিনৰ জটিল নিয়ন্ত্ৰণক প্ৰতিফলিত কৰিব পাৰে।
RC-LH114-W ত ৬টা কাৰ্ডিঅ’লিপিন (CDL), ৭টা ফছফেটিডাইলক’লিন (POPC), ১টা ফছফেটিডাইলগ্লিচাৰল (POPG) আৰু ২৯টা β-DDM অণু আবণ্টন কৰা হয় আৰু ইয়াত ৬টা CDL, ২৪টা POPC, ২টা POPG আৰু ১২টা βDDMৰ আৰ্হি প্ৰস্তুত কৰা হয়। RC-LH116 (চিত্ৰ ৫, ক আৰু খ)। এই দুটা গঠনত চিডিএল কমপ্লেক্সৰ চাইট’প্লাজমিক ফালে প্ৰায় অৱস্থিত, আনহাতে পিঅ’পিচি, পিঅ’পিজি আৰু β-ডিডিএম বেছিভাগেই লুমিনেল ফালে অৱস্থিত। RC-LH114-W কমপ্লেক্সৰ αβ-1ৰ পৰা αβ-6 অঞ্চলত দুটা লিপিড আৰু ডিটাৰজেন্ট অণু পৃথক কৰা হৈছিল (চিত্ৰ 5A), আৰু পাঁচটা RC-LH116ৰ সমতুল্য অঞ্চলত পৃথক কৰা হৈছিল (চিত্ৰ 5B)। কমপ্লেক্সটোৰ সিটো পাৰে অধিক লিপিড পোৱা গৈছিল, মূলতঃ চিডিএল, আৰচি আৰু αβ-৭ৰ পৰা αβ-১৩ৰ মাজত জমা হোৱা (চিত্ৰ ৫, এ আৰু বি)। অন্যান্য গাঁথনিগতভাৱে সমাধান হোৱা লিপিড আৰু ডিটাৰজেন্টসমূহ LH1 আঙঠিৰ বাহিৰত অৱস্থিত আৰু ভালদৰে সমাধান কৰা এচিল শৃংখলসমূহ LH1 উপ-ইউনিটৰ মাজত বিস্তৃত হয়, আংশিকভাৱে RC-LH114-W ত β-DDM হিচাপে চিহ্নিত কৰা হয় আৰু β-DDM আৰু POPC-LH116 ৰ মিশ্ৰণত β-DDM হিচাপে সংজ্ঞায়িত কৰা হয়। আমাৰ গঠনত চিলেটিং লিপিড আৰু ডিটাৰজেণ্টৰ একে ধৰণৰ অৱস্থানে ইংগিত দিয়ে যে ইহঁত শাৰীৰিকভাৱে প্ৰাসংগিক বান্ধনি স্থান (চিত্ৰ S12A)। Tch ত সমতুল্য অণুৰ অৱস্থানৰো ভাল সামঞ্জস্য থাকে। কোমল আৰু Trv. ষ্ট্ৰেইন 970 RC-LH1s (চিত্ৰ S12, B to E) (9, 12) আৰু লিপিড হেড গোটৰ হাইড্ৰজেন-বণ্ডিং অৱশিষ্টই ক্ৰম প্ৰান্তিককৰণত মোটামুটি ভাল সংৰক্ষণ দেখুৱাইছে (চিত্ৰ S13), ইয়াৰ পৰা বুজা যায় যে RC (24) ৰ সৈতে বান্ধ খাই থকা সংৰক্ষিত CDL, এই স্থানসমূহ RC-LH1 কমপ্লেক্সত সংৰক্ষিত হ'ব পাৰে।
(A আৰু B) RC-LH114-W (A) আৰু RC-LH116 (B) পেপটাইডক কাৰ্টুনৰ দ্বাৰা দেখুওৱা হৈছে, আৰু ৰংবোৰক ৰডৰ দ্বাৰা দেখুওৱা হৈছে, চিত্ৰ 1 ৰ ৰঙৰ আঁচনি ব্যৱহাৰ কৰি। RC QA আৰু QB ছাইটৰ সৈতে বান্ধ খাই থকা UQ হালধীয়া, আনহাতে পৃথক UQ নীলা। (C আৰু D) (A) আৰু (B) ৰ দৰেই একে দৃষ্টিভংগী, লিপিড বাদ দিয়া হৈছে। (E ৰ পৰা G) RC-LH116 ৰ পৰা Q1(E), Q2(F) আৰু Q3(G) ৰ বৃদ্ধি কৰা দৃশ্য, ইটোৱে সিটোক প্ৰভাৱিত কৰা কাষৰ শৃংখলৰ সৈতে। হাইড্ৰজেন বান্ধনীবোৰ ক’লা ডেছ ৰেখা হিচাপে দেখুওৱা হৈছে।
RC-LH116 ত আধান পৃথকীকৰণ প্ৰক্ৰিয়াত ইলেক্ট্ৰন স্থানান্তৰত অংশগ্ৰহণ কৰা RC QA আৰু QB UQ দুয়োটাকে ইহঁতৰ বান্ধনি স্থানত পচি যায়। কিন্তু RC-LH114-W ত QB quinone ৰ সমাধান হোৱা নাই আৰু তলত বিতংভাৱে আলোচনা কৰা হ’ব। QA আৰু QB কুইননৰ উপৰিও দুটা চিলেটেড UQ অণু (RC আৰু LH1 আঙঠিৰ মাজত অৱস্থিত) RC-LH114-W গঠনত ইহঁতৰ ভালদৰে সমাধান কৰা মূৰ গোট অনুসৰি (ক্ৰমে Q1 আৰু Q2 ত অৱস্থিত) আবণ্টন কৰা হয়। স্থান)। চিত্ৰ ৫গ)। Q1 ত দুটা আইছ'প্ৰিন একক নিযুক্ত কৰা হয়, আৰু ঘনত্বৰ মানচিত্ৰই Q2 ৰ সম্পূৰ্ণ ১০টা আইছ'প্ৰিন ঠেং সমাধান কৰে। RC-LH116 ৰ গঠনত তিনিটা চিলেটেড UQ10 অণু (Q1 ৰ পৰা Q3, চিত্ৰ 5D) সমাধান হৈছিল, আৰু সকলো অণুৰ গোটেই ঠেংখনতে স্পষ্ট ঘনত্ব থাকে (চিত্ৰ 5, D ৰ পৰা G)। দুয়োটা গঠনত Q1 আৰু Q2 ৰ কুইনন হেড গোটৰ অৱস্থানত উৎকৃষ্ট সামঞ্জস্য থাকে (চিত্ৰ S12F), আৰু ইহঁতে কেৱল RC ৰ সৈতেহে ক্ৰিয়া কৰে। Q1 RC-LH114-W ৰ W ফাঁকৰ প্ৰৱেশদ্বাৰত অৱস্থিত (চিত্ৰ 1G আৰু 5, C, D আৰু E), আৰু Q2 QB বান্ধনি স্থানৰ ওচৰত অৱস্থিত (চিত্ৰ 5, C, D) আৰু F)। সংৰক্ষিত L-Trp143 আৰু L-Trp269 অৱশিষ্ট Q1 আৰু Q2 ৰ অতি ওচৰত আৰু সম্ভাৱ্য π-ষ্টেকিং পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া প্ৰদান কৰে (চিত্ৰ 5, E আৰু F, আৰু চিত্ৰ S12)। Q1 ৰ দূৰৱৰ্তী অক্সিজেনৰ পৰা 3.0 Å দূৰত্বত থকা L-Gln88 এ এটা শক্তিশালী হাইড্ৰজেন বন্ধন প্ৰদান কৰে (চিত্ৰ 5E); এই অৱশিষ্টটো আটাইতকৈ দূৰৈৰ সম্পৰ্কটোৰ বাহিৰে সকলো আৰ চিতে সংৰক্ষিত হয় (চিত্ৰ S13)। L-Ser91 অন্য বেছিভাগ RC ত Thr ৰ সলনি ৰক্ষণশীলভাৱে প্ৰতিস্থাপিত (চিত্ৰ S13), Q1 ৰ মিথাইল অক্সিজেনৰ পৰা 3.8 Angstroms, আৰু ই দুৰ্বল হাইড্ৰজেন বান্ধনী প্ৰদান কৰিব পাৰে (চিত্ৰ 5E)। Q3 ৰ কোনো নিৰ্দিষ্ট পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া দেখা নাযায়, কিন্তু RC-M উপ-ইউনিট আৰু LH1-α উপ-ইউনিট 5 ৰ পৰা 6 ৰ মাজৰ হাইড্ৰ'ফ'বিক অঞ্চলত অৱস্থিত (চিত্ৰ 5, D আৰু G)। Q1, Q2 আৰু Q3 বা ওচৰৰ চিলেটেড কুইননসমূহো Tch ত সমাধান কৰা হৈছে। কোমল, Trv. ষ্ট্ৰেইন ৯৭০ আৰু বি.এল.চি. আইৰিছৰ গঠন (9, 10, 12) RC-LH1 কমপ্লেক্সত এটা সংৰক্ষিত সহায়ক কুইনন বান্ধনি স্থানলৈ আঙুলিয়াই দিয়ে (চিত্ৰ S12G)। RC-LH116 ত পাঁচটা পচি যোৱা UQ উচ্চ প্ৰদৰ্শন তৰল ক্ৰ'মাট'গ্ৰাফী (HPLC) দ্বাৰা নিৰ্ধাৰিত প্ৰতিটো কমপ্লেক্সৰ 5.8±0.7 ৰ সৈতে ভাল একমত, আনহাতে RC-LH114-W ত তিনিটা পচি যোৱা UQ তকৈ কম।
ছ্যুড’-চিমেট্ৰিক এল আৰু এম পলিপেপটাইডত প্ৰত্যেকতে পাঁচটা টিএমএইচ থাকে আৰু ই এটা হেটেৰ’ডাইমাৰ গঠন কৰে যিয়ে এটা বিচিএইচএল ডাইমাৰ, দুটা বিচিএইচএল মনোমাৰ, দুটা বেক্টেৰিয়াফেজ (বিপিএইচ) মনোমাৰ, আৰু এটা নন-হিম আইৰণ আৰু এটা বা দুটা ইউকিউ১০ অণুৰ সংমিশ্ৰণ ঘটায়। টাৰ্মিনেল কিটন গোটত হাইড্ৰজেন বান্ধনীৰ উপস্থিতি আৰু ইয়াৰ Rps ত জনাজাত সঞ্চয়ৰ জৰিয়তে কেৰটিনয়ডসমূহ M-চাবইউনিটত অন্তৰ্ভুক্ত হয়, যাক cis-3,4-dehydroorhodopin বুলি কোৱা হয়। প্ৰজাতি (২৫)। আৰ চি-এইচৰ বাহিৰৰ পৰ্দাৰ ডমেইনটো এটা টি এম এইচৰ দ্বাৰা পৰ্দাৰ লগত লংঘন কৰা হয়। সামগ্ৰিকভাৱে আৰ চি গঠন আনুষংগিক প্ৰজাতিৰ (যেনে Rba) তিনিটা উপ-ইউনিট আৰ চিৰ সৈতে একে। স্ফেৰ’ইড (পিডিবি আইডি: ৩আই৪ডি)। BChl আৰু BPh ৰ মেক্ৰ'চাইকেল, কেৰটিন'ইড মেৰুদণ্ড আৰু নন-হিম আইৰণ এই গঠনসমূহৰ ৰিজ'লিউচন পৰিসৰৰ ভিতৰত ওভাৰলেপ হয়, লগতে QA স্থানত UQ10 হেড গ্ৰুপ আৰু RC-LH116 ত QB কুইনন (চিত্ৰ S15)।
বিভিন্ন কিউবি স্থান দখলৰ হাৰৰ সৈতে দুটা আৰ চি গঠনৰ উপলব্ধতাই কিউবি কুইনন বান্ধনিৰ লগত হোৱা সামঞ্জস্যপূৰ্ণ ৰূপান্তৰকৰণ পৰিৱৰ্তন পৰীক্ষা কৰাৰ এক নতুন সুযোগ প্ৰদান কৰে। আৰ চি-এলএইচ১১৬ কমপ্লেক্সত কিউবি কুইনন সম্পূৰ্ণৰূপে বান্ধ খাই থকা “প্ৰক্সিমেল” অৱস্থাত অৱস্থিত (২৬), কিন্তু আৰচি-এলএইচ১১৪-ডব্লিউৰ পৃথকীকৰণত কিউবি কুইনন নাথাকে। RC-LH114-W ত QB কুইনন নাই, যিটো আচৰিত কাৰণ কমপ্লেক্সটো সক্ৰিয়, গাঁথনিগতভাৱে ৰিজ’লিউচন কৰা QB কুইনন থকা RC-LH116 কমপ্লেক্সতকৈ বেছি। যদিও LH1 আঙঠি দুটাই প্ৰায় ছটা কুইনন চিলেট কৰে, বন্ধ RC-LH116 আঙঠিত পাঁচটা গাঁথনিগতভাৱে ৰিজ'লিউচন হয়, আনহাতে মুকলি RC-LH114-W আঙঠিত মাত্ৰ তিনিটা গাঁথনিগতভাৱে সীমিত। এই বৃদ্ধি পোৱা গাঁথনিগত বিকাৰে RC-LH114-W QB স্থানৰ দ্ৰুত প্ৰতিস্থাপন, কমপ্লেক্সত দ্ৰুত কুইনন গতিবিদ্যা আৰু LH1 লুপ অতিক্ৰম কৰাৰ সম্ভাৱনা বৃদ্ধি প্ৰতিফলিত কৰিব পাৰে। RC-LH114-W ৰ RC QB স্থানত UQ ৰ অভাৱ অধিক জটিল আৰু অধিক সক্ৰিয় কমপ্লেক্সৰ ফল হ'ব পাৰে, আৰু RC-LH114-W ৰ QB স্থান UQ টাৰ্ণঅভাৰত তৎক্ষণাত ফ্ৰীজ হৈ পৰিছে নিৰ্দিষ্ট পৰ্যায়টোৱে (QB ছাইটৰ প্ৰৱেশদ্বাৰ বন্ধ কৰা হৈছে) এই কাৰ্য্যকলাপৰ ৰূপান্তৰ প্ৰতিফলিত কৰে।
QB অবিহনে L-Phe217 ৰ সংলগ্ন ঘূৰ্ণন UQ10 বান্ধনিৰ সৈতে অসঙ্গতিপূৰ্ণ অৱস্থালৈ, কাৰণ ই ঠেংৰ প্ৰথম আইছ'প্ৰিন এককৰ সৈতে স্থানীয় সংঘৰ্ষৰ সৃষ্টি কৰিব (চিত্ৰ 6A)। তদুপৰি, স্পষ্ট মূল ৰূপান্তৰ পৰিৱৰ্তন স্পষ্ট, বিশেষকৈ হেলিক্স ডি (TMH D আৰু E ৰ মাজৰ লুপত চুটি হেলিক্স) য'ত L-Phe217 QB বান্ধনি পকেটলৈ স্থানান্তৰ কৰা হয় আৰু L-Tyr223 ৰ ঘূৰ্ণন (চিত্ৰ 6A) M-Asp45 কাঠামোৰ সৈতে হাইড্ৰজেন বন্ধন ভাঙি QB বান্ধনি স্থানৰ প্ৰৱেশদ্বাৰ বন্ধ কৰিবলৈ (চিত্ৰ ৬খ)। হেলিক্স ডি পিভট ইয়াৰ ভিত্তিত, L-Ser209 ৰ Cα 0.33Å স্থানান্তৰিত হয়, আনহাতে L-Val221Cα 3.52Å স্থানান্তৰিত হয়। টি এম এইচ ডি আৰু ইত কোনো ধৰণৰ পৰ্যবেক্ষণযোগ্য পৰিৱৰ্তন দেখা নাযায়, যিবোৰ দুয়োটা গঠনতে চুপাৰিম্প’জেবল (চিত্ৰ ৬A)। আমি জনাত প্ৰাকৃতিক আৰ চিৰ এইটোৱেই প্ৰথম গঠন যিয়ে কিউবি ছাইটটো বন্ধ কৰি দিয়ে। সম্পূৰ্ণ (QB-বাউণ্ড) গঠনৰ সৈতে তুলনা কৰিলে দেখা যায় যে কুইনন হ্ৰাস কৰাৰ আগতে ইয়াক কুইননত প্ৰৱেশ কৰিবলৈ এটা ৰূপান্তৰ পৰিৱৰ্তনৰ প্ৰয়োজন হয়। L-Phe217 ঘূৰি কুইনন হেড গোটৰ সৈতে π-ষ্টেকিং পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া গঠন কৰে আৰু হেলিক্স বাহিৰলৈ স্থানান্তৰিত হয়, যাৰ ফলত L-Gly222 ৰ কংকাল আৰু L-Tyr223 ৰ কাষৰ শৃংখলে এটা সুস্থিৰ হাইড্ৰজেন বন্ধন গঠনৰ সৈতে হাইড্ৰজেন বন্ধন নেটৱৰ্ক গঠন কৰিবলৈ অনুমতি দিয়ে (চিত্ৰ 6, A আৰু C)।
(A) হ'ল'গ্ৰাম (L শৃংখল, কমলা/M শৃংখল, মেজেন্টা) আৰু এপ' (ধূসৰ) গঠনৰ ওপৰত ওপৰ সোমাই থকা কাৰ্টুন, য'ত মূল অৱশিষ্টবোৰ ৰডৰ দৰে উপস্থাপনৰ আকাৰত প্ৰদৰ্শিত হয়। UQ10ক হালধীয়া ৰঙৰ বাৰেৰে প্ৰতিনিধিত্ব কৰা হয়। বিন্দুযুক্ত ৰেখাই সমগ্ৰ গঠনটোত গঠিত হাইড্ৰজেন বান্ধোনবোৰক সূচায়। (B আৰু C) এপলিপোপ্ৰটিন আৰু গোটেই আঙঠিৰ গঠনৰ পৃষ্ঠৰ উপস্থাপন, ক্ৰমে নীলা ৰঙেৰে L-Phe217 আৰু ৰঙা ৰঙেৰে L-Tyr223 ৰ কাষৰ শৃংখলৰ অক্সিজেনক উজ্জ্বল কৰি তোলা। এল উপ-ইউনিটটো কমলা ৰঙৰ; M আৰু H উপ-ইউনিটবোৰ ৰঙীন নহয়। (D আৰু E) এপলিপ'প্ৰটিন (D) আৰু গোটেই (E) RC QB স্থান [ক্ৰমে (A) অনুসৰি ৰং] আৰু থাৰ্মোফিলাছ থাৰ্মোফিলাছ PSII (সেউজীয়া, প্লাষ্টিক কুইননৰ সৈতে নীলা; PDB ID: 3WU2) প্ৰান্তিককৰণ কৰক (58)।
অপ্ৰত্যাশিতভাৱে, যদিও LH1 অবিহনে QB-অভাৱী RC ৰ কেইবাটাও গঠন উপলব্ধ, এই অধ্যয়নত পৰ্যবেক্ষণ কৰা কনফৰ্মেচনেল পৰিৱৰ্তনৰ বিষয়ে পূৰ্বে ৰিপৰ্ট কৰা হোৱা নাই। ইয়াৰ ভিতৰত আছে Blc ৰ পৰা QB ডিপ্লিচন ষ্ট্ৰাকচাৰ। viridis (পিডিবি আইডি: ৩পিআৰচি) (২৭), Tch. টেপিডাম (পিডিবি আইডি: ১ইৱাইএছ) (২৮) আৰু আৰবা। স্ফেৰ'ইড (PDB ID: 1OGV) (29), যিবোৰৰ সকলোবোৰ সামগ্ৰিক QB গঠনৰ সৈতে প্ৰায় একে। 3PRC ৰ নিবিড় পৰীক্ষাত দেখা গ’ল যে LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ডিটাৰজেন্ট অণুৱে QB অৱস্থানৰ প্ৰৱেশদ্বাৰত বান্ধ খায়, যিয়ে বন্ধ ৰূপান্তৰত পুনৰ বিন্যাস কৰাত বাধা দিব পাৰে। যদিও 1EYS বা 1OGV ত LDAO একে স্থানতে পচি নাযায়, এই RC সমূহ একেটা ডিটাৰজেন্ট ব্যৱহাৰ কৰি প্ৰস্তুত কৰা হয় আৰু সেয়েহে একে প্ৰভাৱ পেলাব পাৰে। Rba ৰ স্ফটিক গঠন। চাইট’ক্ৰ’ম c2 (PDB ID: 1L9B) ৰ সৈতে সহ-স্ফটিকীয়কৃত স্ফেৰ’ইডছ আৰ চিৰ এটাও বন্ধ QB স্থান থকা যেন লাগে। এই ক্ষেত্ৰত RC-M পলিপেপটাইডৰ N-টাৰ্মিনেল অঞ্চলে (Q হেলিক্সত Tyr অৱশিষ্টৰ H বন্ধনৰ জৰিয়তে QB বান্ধনি স্থানৰ সৈতে পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া কৰি) এটা অপ্ৰাকৃতিক ৰূপান্তৰ গ্ৰহণ কৰে, আৰু QB ৰূপান্তৰকৰণৰ পৰিৱৰ্তন অধিক অন্বেষণ কৰা নহয় (30)। আশ্বস্ত কৰা কথাটো হ’ল আমি RC-LH114-W গঠনত M পলিপেপটাইডৰ এই ধৰণৰ বিকৃতি দেখা নাই, যিটো RC-LH116 RC ৰ N-terminal অঞ্চলৰ সৈতে প্ৰায় একে। ইয়াৰ উপৰিও মন কৰিবলগীয়া যে ডিটাৰজেণ্ট ভিত্তিক এল এইচ ১ এন্টেনা নিৰ্মূল কৰাৰ পিছত পি ডি বিৰ এপলিপ’প্ৰটিন আৰ চি সমূহ সমাধান হৈছিল, যাৰ ফলত আৰ চি আৰু চাৰিওফালৰ এল এইচ ১ আঙঠিৰ ভিতৰৰ পৃষ্ঠৰ মাজৰ ফাঁকত থকা আভ্যন্তৰীণ কুইনন পুল আৰু লিপিডবোৰ নাইকিয়া হৈছিল (৩১, ৩২)। আৰ চি কাৰ্যক্ষম হৈ থাকে কাৰণ ই সকলো কোফেক্টৰ ধৰি ৰাখে, পচিব পৰা কিউবি কুইননৰ বাহিৰে, যিটো কম সুস্থিৰ আৰু প্ৰস্তুতি প্ৰক্ৰিয়াৰ সময়ত প্ৰায়ে হেৰাই যায় (৩৩)। ইয়াৰ উপৰিও জনা যায় যে আৰ চিৰ পৰা এল এইচ ১ আৰু প্ৰাকৃতিক চক্ৰীয় লিপিড আঁতৰাই পেলোৱাৰ ফলত কাৰ্য্যসমূহৰ ওপৰত প্ৰভাৱ পৰিব পাৰে, যেনে আধান-বিভাজিত পি+কিউবি-অৱস্থাৰ আয়ুস কম হোৱা (৩১, ৩৪, ৩৫)। গতিকে আমি অনুমান কৰোঁ যে আৰ চিক আগুৰি থকা স্থানীয় এল এইচ ১ আঙঠিটোৰ অস্তিত্বই “বন্ধ” কিউ বি স্থানটো বজাই ৰাখিব পাৰে, যাৰ ফলত কিউবিৰ ওচৰৰ স্থানীয় পৰিৱেশটো সংৰক্ষণ হ’ব পাৰে।
যদিও এপলিপ'প্ৰটিন (কিউবি কুইনন অবিহনে) আৰু সম্পূৰ্ণ গঠনে কিউবি ছাইটৰ টাৰ্ণঅভাৰৰ মাত্ৰ দুটা স্নেপশ্বটহে প্ৰতিনিধিত্ব কৰে, ধাৰাবাহিক পৰিঘটনাৰ পৰিৱৰ্তে, ইয়াৰ ইংগিত আছে যে হাইড্ৰ'কুইননৰ দ্বাৰা পুনৰ বান্ধোন ৰোধ কৰিবলৈ বান্ধনিটোক গেট কৰিব পাৰি ছাবষ্ট্ৰেট নিষেধক বাধা দিবলৈ। এপলিপ’প্ৰটিনৰ কিউবি স্থানৰ ওচৰত কুইনলল আৰু কুইননৰ পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া বেলেগ হ’ব পাৰে, যাৰ ফলত ইয়াক আৰ চিয়ে প্ৰত্যাখ্যান কৰে। দীৰ্ঘদিন ধৰি প্ৰস্তাৱ কৰা হৈছে যে কনফৰ্মেচনেল পৰিৱৰ্তনে কুইননৰ বান্ধোন আৰু হ্ৰাসত ভূমিকা পালন কৰে। আন্ধাৰ অভিযোজনৰ পিছত ফ্ৰ’জেন আৰ চিৰ কুইনন হ্ৰাস কৰাৰ ক্ষমতা ক্ষতিগ্ৰস্ত হয় (৩৬); এক্স-ৰে স্ফটিকবিজ্ঞানে দেখুৱাইছে যে এই ক্ষতিৰ কাৰণ হৈছে সক্ৰিয় প্ৰক্সিমেল অৱস্থানৰ পৰা প্ৰায় ৪.৫ Å দূৰত্বত “দূৰৱৰ্তী” কনফৰ্মেচনত আবদ্ধ হৈ থকা QB quinones (26) , 37)। এই দূৰৱৰ্তী বান্ধনি ৰূপান্তৰটো এপলিপ'প্ৰটিন আৰু সম্পূৰ্ণ আঙঠি গঠনৰ মাজৰ মধ্যৱৰ্তী অৱস্থাৰ এটা স্নেপশ্বট, যিয়ে কুইননৰ সৈতে প্ৰাৰম্ভিক পাৰস্পৰিক ক্ৰিয়া আৰু কিউবি স্থানৰ মুকলি অনুসৰণ কৰে।
কিছুমান ফটোট্ৰফিক বেক্টেৰিয়া আৰু চাইনোবেক্টেৰিয়া, শেলাই আৰু উদ্ভিদৰ পি এছ আই আই কমপ্লেক্সত পোৱা দ্বিতীয় প্ৰকাৰৰ আৰ চিৰ গাঁথনিগত আৰু কাৰ্য্যকৰী সংৰক্ষণ আছে (৩৮)। চিত্ৰ ৬ (D আৰু E)ত দেখুওৱা গাঁথনিগত প্ৰান্তিককৰণে পিএছআইআই আৰচি আৰু বেক্টেৰিয়াৰ আৰচি কমপ্লেক্সৰ কিউবি স্থানৰ মাজৰ সাদৃশ্যৰ ওপৰত গুৰুত্ব আৰোপ কৰে। এই তুলনা দীৰ্ঘদিন ধৰি কুইনন বান্ধনি আৰু হ্ৰাসৰ ঘনিষ্ঠ সম্পৰ্কীয় ব্যৱস্থাসমূহ অধ্যয়নৰ বাবে এক আৰ্হি হৈ আহিছে। পূৰ্বৰ প্ৰকাশনসমূহে প্ৰস্তাৱ দিছিল যে কনফৰ্মেচনেল পৰিৱৰ্তনৰ লগে লগে কুইননৰ PSII হ্ৰাস ঘটে (39, 40)। গতিকে আৰ চিৰ বিৱৰ্তনশীল সংৰক্ষণৰ কথা বিবেচনা কৰিলে পূৰ্বতে পৰ্যবেক্ষণ নোহোৱা এই বান্ধনি ব্যৱস্থাটো অক্সিজেনযুক্ত ফটোট্ৰফিক উদ্ভিদত পি এছ আই আই আৰ চিৰ কিউ বি স্থানৰ ক্ষেত্ৰতো প্ৰযোজ্য হ’ব পাৰে।
Rps ΔpufW (লেবেলবিহীন pufW ডিলিচন) আৰু PufW-His (প্ৰাকৃতিক pufW লোকাছৰ পৰা প্ৰকাশ কৰা C-টাৰ্মিনেল 10x His-টেগ কৰা প্ৰটিন-W) ষ্ট্ৰেইন। palustris CGA009 আমাৰ পূৰ্বৰ কামত বৰ্ণনা কৰা হৈছিল (16)। এই ষ্ট্ৰেইন আৰু আইছ’জেনিক বন্য-প্ৰকাৰৰ পিতৃ-মাতৃক ফ্ৰীজৰ পৰা PYE (প্ৰতিটো ৫ গ্ৰাম লিটাৰ -১) (-৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত LB ত সংৰক্ষণ কৰা, ৫০% ( w/v) গ্লিচাৰল) প্ৰটিন, ঈষ্টৰ নিষ্কাশন আৰু চুচিনেট) এগাৰ [১.৫% (w/v)] প্লেটত ষ্ট্ৰিকিং কৰি উদ্ধাৰ কৰা হৈছিল। প্লেটখনক এনাৰোবিক পৰিস্থিতিত কোঠাৰ উষ্ণতাত আন্ধাৰত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত OSRAM 116-W হেল’জেন বাল্ব (RS Components, UK) দ্বাৰা প্ৰদান কৰা বগা পোহৰেৰে (~50 μmolm-2 s-1) ৩ৰ পৰা ৫ দিনলৈকে আলোকিত কৰা হৈছিল যেতিয়ালৈকে এটা কলনী দেখা নাযায়। ০.১% (w/v) কেছামিনো এচিড (ইয়াৰ পিছত M22 বুলি কোৱা হ’ব)ৰ পৰিপূৰক ১০ মিলিলিটাৰ M22+ মাধ্যম (৪১) টিকাকৰণ কৰিবলৈ এটা কলনী ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ৩৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত আন্ধাৰত কম অক্সিজেনৰ অৱস্থাত ১৮০ আৰ পি এমত ৪৮ ঘণ্টা জোকাৰি কালচাৰটো ডাঙৰ কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত ৭০ মিলিলিটাৰ কালচাৰ একে পৰিস্থিতিত ২৪ ঘণ্টা ধৰি টিকাকৰণ কৰা হৈছিল। ১ মিলিলিটাৰ আয়তনৰ অৰ্ধ-বায়ুবায়ু কালচাৰ ব্যৱহাৰ কৰি ৩০ মিলিলিটাৰ ইউনিভাৰ্চেল স্ক্ৰু-টপ স্বচ্ছ কাঁচৰ বটলত ৩০ মিলিলিটাৰ M22 মাধ্যম টিকাকৰণ কৰা হয় আৰু বীজাণুমুক্ত চুম্বকীয় বলৰ দ্বাৰা ৪৮ ঘণ্টা ধৰি আন্দোলন (~৫০μmolm-2 s-1) দ্বাৰা বিকিৰণ কৰা হয়। তাৰ পিছত ৩০ মিলিলিটাৰ কালচাৰক একে পৰিস্থিতিত প্ৰায় ১ লিটাৰ কালচাৰৰ সৈতে ইনকুলেচন কৰা হয়, যিটো ব্যৱহাৰ কৰি ~২০০ μmolm-2 s-1 ত আলোকিত কৰা প্ৰায় ৯ লিটাৰ কালচাৰত ৭২ ঘণ্টা টিকাকৰণ কৰা হয়। ৭১৩২ আৰ চি এফত ৩০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰি কোষবোৰ সংগ্ৰহ কৰি ~১০ মিলিলিটাৰ ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচ চি এল (পি এইচ ৮.০)ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰা হৈছিল আৰু প্ৰয়োজন নোহোৱালৈকে -২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত সংৰক্ষণ কৰা হৈছিল।
গলি যোৱাৰ পিছত পুনৰ স্থলবন্দী কোষবোৰত ডিঅক্সিৰাইব’নিউক্লিয়েজ I (মাৰ্ক, ইউ কে), লাইছ’জাইম (মাৰ্ক, ইউ কে) আৰু দুটা ৰ’চ হ’ল’এনজাইম প্ৰটিজ ইনহিবিটাৰ টেবলেট (মাৰ্ক, ইউ কে)ৰ কিছু স্ফটিক যোগ কৰিব লাগে। ২০,০০০ পিএছআইৰ ফৰাচী চাপ কোষ (আমেৰিকাৰ এমিনকো)ত কোষবোৰ ৮ৰ পৰা ১২ বাৰ বিঘ্নিত কৰা হৈছিল। ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫ মিনিটৰ বাবে ১৮,৫০০ আৰ চি এফত কেন্দ্ৰচালিত কৰি অভগ্ন কোষ আৰু অদ্ৰৱণীয় ধ্বংসাৱশেষ আঁতৰোৱাৰ পিছত ৪৩,০০০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২ ঘণ্টা ধৰি ১১৩,০০০ আৰ চি এফত কেন্দ্ৰচালিত কৰি ৰংযুক্ত লাইছেটৰ পৰা পৰ্দাখন বৃষ্টিপাত কৰা হ’ল। দ্ৰৱণীয় অংশটো পেলাই দি ৰঙীন আৱৰণখন ১০০ৰ পৰা ২০০ মিলিলিটাৰ ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৮.০)ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰি লওক আৰু কোনো দৃশ্যমান গোটা পদাৰ্থ নোহোৱালৈকে সমতা স্থাপন কৰক। স্থলবন্দী পৰ্দাখন ২% (w/v) β-DDM যুক্ত ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৮.০) (এনাট্ৰেচ, আমেৰিকা)ত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত আন্ধাৰত ১ ঘণ্টা ধৰি লাহে লাহে লৰাই ৰখা হৈছিল। তাৰ পিছত ৭০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত চেণ্ট্ৰিফিউজ কৰি ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ১৫০,০০০ আৰ চি এফ ১ ঘণ্টা ধৰি দ্ৰৱীভূত কৰি অৱশিষ্ট অদ্ৰৱণীয় পদাৰ্থ আঁতৰাই পেলাওক।
ΔpufW ষ্ট্ৰেইনৰ পৰা দ্ৰৱীভূতকৰণ পৰ্দাখন 50 মিলিলিটাৰ DEAE Sepharose আয়ন বিনিময় স্তম্ভত তিনিটা স্তম্ভ আয়তন (CV) বান্ধনি বাফাৰ [20 mM tris-HCl (pH 8.0) যুক্ত 0.03% (w / v) β-DDM যুক্ত]ৰ সৈতে প্ৰয়োগ কৰা হৈছিল। স্তম্ভটো দুটা চিভি বান্ধনি বাফাৰেৰে ধুব, আৰু তাৰ পিছত স্তম্ভটো ৫০ মিলিমিটাৰ NaCl যুক্ত দুটা বান্ধনি বাফাৰেৰে ধুব। RC-LH116 কমপ্লেক্সটোক ১.৭৫ চিভিত ১৫০ৰ পৰা ৩০০ মিলিমিটাৰ NaCl (বাইণ্ডিং বাফাৰত) ৰৈখিক গ্ৰেডিয়েণ্টেৰে এলুট কৰা হৈছিল আৰু বাকী থকা বান্ধনি কমপ্লেক্সটোক ০.৫ চিভিত ৩০০ মিলিমিটাৰ NaCl যুক্ত বান্ধনি বাফাৰেৰে এলুট কৰা হৈছিল। ২৫০ আৰু ১০০০ এন এমৰ ভিতৰত শোষণ বৰ্ণালী সংগ্ৰহ কৰি ৮৮০ৰ পৰা ২৮০ এন এমত ১তকৈ অধিক শোষণ অনুপাত (A880/A280) থকা ভগ্নাংশটো ৰাখক, বান্ধনি বাফাৰত দুবাৰ পাতল কৰক আৰু বিশুদ্ধকৰণৰ সময়ত DEAE স্তম্ভত পুনৰ একে পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰক। 1.7 তকৈ অধিক A880/A280 অনুপাত আৰু 3.0 তকৈ অধিক A880/A805 অনুপাত থকা ভগ্নাংশবোৰ পাতল কৰি তৃতীয় ৰাউণ্ডৰ আয়ন বিনিময় কৰক আৰু A880/A280 অনুপাত ২.২তকৈ অধিক আৰু A880/A805 অনুপাত ৫.০তকৈ বেছি থকা ভগ্নাংশবোৰ ধৰি ৰাখক। আংশিকভাৱে বিশুদ্ধ কমপ্লেক্সটোক Amicon 100,000 আণৱিক ওজন কাট-অফ (MWCO) কেন্দ্ৰপৃথক ফিল্টাৰ (Merck, UK)ত ~2 মিলিলিটাৰলৈ ঘনীভূত কৰা হৈছিল আৰু 200 mM NaCl বাফাৰ যুক্ত Superdex 200 16/600 আকাৰৰ বৰ্জন কলামত (GE Healthcare, US) লোড কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত একেটা বাফাৰত 1.5 CV ত এলুট কৰা হৈছিল। আকাৰ বাদ দিয়া অংশৰ শোষণ বৰ্ণালী সংগ্ৰহ কৰক, আৰু শোষণ বৰ্ণালীসমূহ ২.৪ৰ ওপৰত A880/A280 অনুপাত আৰু ৫.৮ৰ পৰা ১০০ A880ৰ ওপৰত A880/A805 অনুপাতৰ সৈতে ঘনীভূত কৰক, আৰু তৎক্ষণাত ক্ৰাইঅ'-টিইএম গ্ৰীড প্ৰস্তুত বা সংৰক্ষণৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰক প্ৰয়োজন নোহোৱালৈকে -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৰাখক।
PufW-His ষ্ট্ৰেইনৰ পৰা দ্ৰৱীভূতকৰণ মেমব্ৰেনটো IMAC বাফাৰ ( GE Healthcare)ত ২০ মিলিলিটাৰ HisPrep FF Ni-NTA Sepharose কলাম (২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-HCl (pH ৮.০) যুক্ত ২০০ মিলিমিটাৰ NaCl আৰু ০.০৩% (w/w))ত প্ৰয়োগ কৰা হৈছিল। v) β-ডিডিএম]। স্তম্ভটো আইএমএচি বাফাৰৰ পাঁচটা চিভিৰে ধুই পেলোৱা হ’ল, আৰু তাৰ পিছত ১০ মিলিমিটাৰ হিষ্টিডিন যুক্ত আইএমএচি বাফাৰৰ পাঁচটা চিভিৰে ধুই পেলোৱা হ’ল। স্তম্ভৰ পৰা কোৰ কমপ্লেক্সটো ১০০ মিলিমিটাৰ হিষ্টিডিন যুক্ত পাঁচটা আইএমএচি বাফাৰেৰে এলুট কৰা হৈছিল। RC-LH114-W কমপ্লেক্স যুক্ত অংশটোক Amicon 100,000 MWCO ফিল্টাৰ (Merck, UK)ৰে সজ্জিত আলোড়িত টেংকত ~10 মিলিলিটাৰলৈ ঘনীভূত কৰা হয়, বান্ধনি বাফাৰেৰে 20 বাৰ পাতল কৰা হয়, আৰু তাৰ পিছত 25 মিলিলিটাৰলৈ যোগ কৰা হয় DEAE Sepharose স্তম্ভত বাফাৰত বান্ধি থোৱা চাৰিটা CV আগতীয়াকৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। স্তম্ভটো চাৰিটা চিভি বান্ধনি বাফাৰেৰে ধুই পেলাওক, তাৰ পিছত ০ৰ পৰা ১০০ মিলিমিটাৰ NaCl ৰ ৰৈখিক গ্ৰেডিয়েণ্টত আঠটা চিভিত কমপ্লেক্সটো এলুট কৰক (বাইণ্ডিং বাফাৰত), আৰু বাকী চাৰিটা চিভিত ১০০ মিলিমিটাৰ বান্ধনি বাফাৰ যুক্ত কৰক 4.6 ভগ্নাংশতকৈ অধিক A880/A805 অনুপাতক এটা Amicon 100,000 MWCO কেন্দ্ৰপৃথক ফিল্টাৰত ~2 মিলিলিটাৰলৈ ঘনীভূত কৰা হৈছিল, আৰু আগতীয়াকৈ 1.5 CV IMAC দ্বাৰা ভৰোৱা হৈছিল বাফাৰ ইকুইলিব্ৰেটেড ছুপাৰডেক্স 200 16/600 আকাৰৰ বৰ্জন স্তম্ভত, আৰু তাৰ পিছত একেটা বাফাৰত 1.5 CV ত এলুট কৰা হৈছিল। আকাৰ-বৰ্জন ভগ্নাংশসমূহৰ শোষণ বৰ্ণালী সংগ্ৰহ কৰক আৰু শোষণ বৰ্ণালীসমূহ ২.১ৰ ওপৰত A880/A280 অনুপাত আৰু ৪.৬ৰ পৰা ১০০ A880 ৰ ওপৰত A880/A805 অনুপাতৰ সৈতে ঘনীভূত কৰক, যিবোৰ তৎক্ষণাত ফ্ৰ’জেন টি ই এম গ্ৰীড প্ৰস্তুতৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয় বা প্ৰয়োজন নোহোৱালৈকে -৮০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত সংৰক্ষণ কৰা হয়।
কম উষ্ণতাৰ টি ই এম গ্ৰীড প্ৰস্তুত কৰিবলৈ লেইকা ই এম জি পি ইমাৰ্চন ফ্ৰীজাৰ ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। কমপ্লেক্সটোক IMAC বাফাৰত ৫০ ৰ A880 লৈ পাতল কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ৫μl নতুনকৈ গ্লো-ডিচাৰ্জ কৰা QUANTIFOIL ১.২/১.৩ কাৰ্বন-আৱৰণযুক্ত তামৰ জাল (Agar Scientific, UK)ত লোড কৰা হৈছিল। গ্ৰীডখন ২০ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছ আৰু ৬০% আপেক্ষিক আৰ্দ্ৰতাত ৩০ ছেকেণ্ডৰ বাবে ইনকিউবেট কৰক, তাৰ পিছত ইয়াক ৩ ছেকেণ্ডৰ বাবে শুকুৱাই লওক, আৰু তাৰ পিছত ইয়াক -১৭৬ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত তৰল ইথেনত নুমুৱাই দিয়ক।
RC-LH114-W কমপ্লেক্সৰ তথ্য eBIC (ইলেক্ট্ৰনিক বায়’ইমেজিং চেণ্টাৰ) (ব্ৰিটিছ ডাইমণ্ড লাইট ছ’ৰ্চ)ত টাইটান ক্ৰ’ছ মাইক্ৰস্কোপৰ সহায়ত ৰেকৰ্ড কৰা হৈছিল, যিয়ে 300kV ত্বৰান্বিত ভল্টেজত কাম কৰে, নামমাত্ৰ বৃদ্ধি 130,000× আৰু শক্তিৰ সৈতে- 20 eV ৰ ব্যৱধান বাছক। তথ্য সংগ্ৰহ কৰিবলৈ গণনা মোডত ছবি ৰেকৰ্ড কৰিবলৈ K2 পিক ডিটেক্টৰৰ সৈতে এটা Gatan 968 GIF Quantum ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। মানাংকিত পিক্সেলৰ আকাৰ ১.০৪৮Å, আৰু মাত্ৰাৰ হাৰ ৩.৮৩ e-Å-2s-১। ১১ ছেকেণ্ডত চিনেমাখন সংগ্ৰহ কৰি ৪০টা ভাগত ভাগ কৰিলে। কাৰ্বন আৱৰণযুক্ত অংশটো ব্যৱহাৰ কৰি মাইক্ৰস্কোপটো পুনৰ কেন্দ্ৰীভূত কৰক, আৰু তাৰ পিছত প্ৰতিটো ফুটাত তিনিটা চিনেমা সংগ্ৰহ কৰক। মুঠতে ৩১৩০ খন চিনেমা সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল, ডিফ’কাছৰ মান -১ আৰু -৩μmৰ ভিতৰত আছিল।
আৰ চি-এল এইচ১১৬ কমপ্লেক্সৰ বাবে তথ্য সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল এষ্টাৰবেৰী বায়’ষ্ট্ৰাকচাৰ লেবৰেটৰী (ইউনিভাৰ্চিটি অৱ লিডছ, ইউ কে)ত একেটা মাইক্ৰস্কোপ ব্যৱহাৰ কৰি। তথ্যসমূহ ১৩০ k বৃদ্ধিৰে গণনা পদ্ধতিত সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল, আৰু পিক্সেলৰ আকাৰ ৪.৬ e-Å-2s-1 ৰ মাত্ৰাৰ সৈতে ১.০৬৫ Å লৈ মানাংকন কৰা হৈছিল। ১২ ছেকেণ্ডত ৰেকৰ্ডিং কৰা চিনেমাখন ৪৮টা ভাগত বিভক্ত কৰা হৈছিল। মুঠতে ৩৩৫৯ খন ফিল্ম সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল, ডিফ’কাছৰ মান -১ আৰু -৩μmৰ ভিতৰত আছিল।
সকলো ডাটা প্ৰচেছিং ৰিলিয়ন ৩.০ পাইপলাইনত (৪২) কৰা হয়। ড'জ ওজন দ্বাৰা ৰশ্মিৰ গতি সংশোধন কৰিবলৈ Motioncorr 2 (43) ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু তাৰ পিছত CTF (কনট্ৰাষ্ট ট্ৰেন্সফাৰ ফাংচন) প্ৰাচল নিৰ্ধাৰণ কৰিবলৈ CTFFIND 4.1 (44) ব্যৱহাৰ কৰক। এই প্ৰাৰম্ভিক প্ৰক্ৰিয়াকৰণ পৰ্যায়সমূহৰ পিছত সাধাৰণ ফটোমাইক্ৰ'গ্ৰাফসমূহ চিত্ৰ 2. S16 ত দেখুওৱা হৈছে। স্বয়ংক্ৰিয় নিৰ্বাচন সাঁচটো ২৫০ পিক্সেলৰ ফ্ৰেমত ১০০০ কণিকাৰ প্ৰায় ২৫০ পিক্সেল আৰু কোনো ৰেফাৰেন্স দ্বিমাত্ৰিক (২D) শ্ৰেণীবিভাজন নিজে নিৰ্বাচন কৰি সৃষ্টি কৰা হয়, যাৰ ফলত নমুনাৰ দূষণ পূৰণ কৰা বা কোনো লক্ষণীয় বৈশিষ্ট্য নথকা শ্ৰেণীবিভাজনসমূহ নাকচ কৰা হয়। তাৰ পিছত সকলো মাইক্ৰ’ফ’ট’গ্ৰাফতে স্বয়ংক্ৰিয় নিৰ্বাচন কৰা হ’ল আৰু আৰ চি-এলএইচ১১৪-ডব্লিউ ৮৪৯,৩৫৯টা কণা, আৰু আৰ চি-এলএইচ১১৬ কমপ্লেক্সত ৪৭৬,৫৪৭টা কণা। নিৰ্বাচিত সকলো কণাকে দুটা ৰাউণ্ডৰ নন-ৰেফাৰেন্স ২ডি শ্ৰেণীবিভাজনৰ সন্মুখীন হৈছে, আৰু প্ৰতিটো দৌৰৰ পিছত কাৰ্বন এলেকা, নমুনাৰ দূষণ, কোনো স্পষ্ট বৈশিষ্ট্য বা শক্তিশালীভাৱে ওপৰত ওপৰ সোমাই থকা কণাবোৰ পূৰণ কৰা কণাবোৰ নাকচ কৰা হয়, যাৰ ফলত ৭৭২,০৩৩ (৯০.৯%) আৰু ৩৫৯,৬৭৮ (৭৫.৫%) কণাবোৰ ৩ডি শ্ৰেণীবিভাজনৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰা হয় ক্ৰমে আৰ চি-এলএইচ১১৪-ডব্লিউ আৰু আৰ চি-এলএইচ১১৬। প্ৰাৰম্ভিক ত্ৰিমাত্ৰিক ৰেফাৰেন্স মডেলটো ষ্ট’কেষ্টিক গ্ৰেডিয়েণ্ট ডেচেণ্ট পদ্ধতি ব্যৱহাৰ কৰি সৃষ্টি কৰা হৈছিল। প্ৰাৰম্ভিক আৰ্হিটোক ৰেফাৰেন্স হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰি নিৰ্বাচিত কণাবোৰক ত্ৰিমাত্ৰিকভাৱে চাৰিটা ভাগত ভাগ কৰা হয়। এই শ্ৰেণীৰ মডেলটোক ৰেফাৰেন্স হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰি, বৃহত্তম শ্ৰেণীৰ কণাসমূহৰ ওপৰত 3D পৰিশোধন কৰক, তাৰ পিছত দ্রাৱক এলেকাটো আবৰিবলৈ প্ৰাৰম্ভিক 15Å লো-পাছ ফিল্টাৰ ব্যৱহাৰ কৰক, 6 পিক্সেল কোমল প্ৰান্ত যোগ কৰক, আৰু পিক্সেলসমূহক পষ্ট-প্ৰচেছ কৰি শীৰ্ষ ডিটেক্টৰৰ Gatan K2 শিখৰ মডুলেচন স্থানান্তৰ কাৰ্য্য সংশোধন কৰক। RC-LH114-W ডাটাছেটৰ বাবে, এই প্ৰাৰম্ভিক মডেলটো মাস্কৰ প্ৰান্তত থকা শক্তিশালী ঘনত্ব আঁতৰাই পৰিবৰ্তন কৰা হৈছিল (UCSF Chimera ত মূল জটিল ঘনত্বৰ পৰা বিচ্ছিন্ন)। ফলস্বৰূপে পোৱা মডেলসমূহ (RC-LH114-W আৰু RC-LH116 ৰ ৰিজ’লিউচন ক্ৰমে ৩.৯১ আৰু ৪.১৬ Å) ত্ৰিমাত্ৰিক শ্ৰেণীবিভাজনৰ দ্বিতীয় ৰাউণ্ডৰ বাবে ৰেফাৰেন্স হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হয়। ব্যৱহৃত কণাবোৰক প্ৰাৰম্ভিক ত্ৰিমাত্ৰিক শ্ৰেণীত গোট কৰা হয় আৰু ইয়াত চুবুৰীৰ সৈতে শক্তিশালী সম্পৰ্ক নাথাকে। ওভাৰলেপ বা স্পষ্ট গাঁথনিগত বৈশিষ্ট্যৰ অভাৱ। 3D শ্ৰেণীবিভাজনৰ দ্বিতীয় ৰাউণ্ডৰ পিছত সৰ্বোচ্চ ৰিজ'লিউচন থকা শ্ৰেণীটো বাছনি কৰা হৈছিল [RC-LH114-W ৰ বাবে এটা শ্ৰেণী হৈছে 377,703 কণা (44.5%), RC-LH116 ৰ বাবে দুটা শ্ৰেণী আছে, মুঠ 260,752 কণা (54.7%) , য'ত প্ৰাৰম্ভিক ঘূৰ্ণনৰ পিছত সৰু পাৰ্থক্যৰ সৈতে প্ৰান্তিককৰণ কৰিলেহে ইহঁত একে হয়]। নিৰ্বাচিত কণাবোৰ ৪০০ পিক্সেলৰ বাকচত পুনৰ উলিয়াই থ্ৰীডি ৰিফাইনিঙৰ দ্বাৰা পৰিশোধন কৰা হয়। প্ৰাৰম্ভিক ১৫Å লো-পাছ ফিল্টাৰ, ৩ পিক্সেল মেপ সম্প্ৰসাৰণ আৰু ৩ পিক্সেল কোমল মাস্ক ব্যৱহাৰ কৰি দ্রাৱক মাস্ক সৃষ্টি কৰা হয়। প্ৰতি-কণা চিটিএফ পৰিশোধন, প্ৰতি-কণা গতি সংশোধন আৰু প্ৰতি-কণা চিটিএফ পৰিশোধনৰ দ্বিতীয় ৰাউণ্ড ব্যৱহাৰ কৰি, প্ৰতিটো পদক্ষেপৰ পিছত ত্ৰিমাত্ৰিক পৰিশোধন, দ্রাৱক মাস্কিং আৰু পষ্ট-প্ৰচেছিং সম্পন্ন কৰি ফলস্বৰূপে টেক্সচাৰক অধিক পৰিশোধন কৰা হয়। 0.143 ৰ FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) কাট-অফ মান ব্যৱহাৰ কৰি RC-LH114-W আৰু RC-LH116 ৰ চূড়ান্ত মডেলৰ ৰিজ'লিউচন ক্ৰমে 2.65 আৰু 2.80Å। চূড়ান্ত আৰ্হিৰ FSC বক্ৰ চিত্ৰ 2. S17 ত দেখুওৱা হৈছে।
সকলো প্ৰটিন ক্ৰম UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5)ৰ পৰা ডাউনলোড কৰা হয়; LH1-α (PufA; ইউনিপ্ৰটআইডি: Q6N9L4); আৰ চি-এল (পাফএল; ইউনিপ্ৰট আইডি: অ৮৩০০৫); আৰ চি-এম (PufM; ইউনিপ্ৰট আইডি: A0A4Z7); আৰ চি-এইচ (পুহএ; ইউনিপ্ৰট আইডি: এ০এ৪জেড৯); প্ৰটিন-ডব্লিউ (PufW; ইউনিপ্ৰট আইডি: Q6N1K3)। RC-L, RC-M আৰু RC-H ৰ প্ৰটিন ক্ৰম আৰু Rba ৰ স্ফটিক গঠন থকা RC ৰ সমতা মডেল নিৰ্মাণ কৰিবলৈ SWISS-MODEL (45) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। sphaeroides RCক টেমপ্লেট হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল (PDB ID: 5LSE) (46)। UCSF Chimera ত “ফিট মেপ” সঁজুলি ব্যৱহাৰ কৰি উৎপন্ন মডেলটো মেপত ফিট কৰক (47), প্ৰটিনৰ গঠন উন্নত কৰক, আৰু কোফেক্টৰ কৰক [4×BChl a (মনোমাৰ লাইব্ৰেৰী অৱশিষ্টৰ নাম = BCL), 2×BPh a (BPH), এটা বা দুবিধ UQ10 (U10), এটা নন-হিম আইৰন (Fe) আৰু এটা 3,4-ডাইহাইড্ৰ'হেক্সাকাৰ্বনাইলক'লাইন (QAK)] যোগ কৰিবলৈ Coot (48) ব্যৱহাৰ কৰক। যিহেতু QAK মনোমাৰ লাইব্ৰেৰীত উপলব্ধ নহয়, ইয়াক PHENIX (49) ত eLBOW সঁজুলি ব্যৱহাৰ কৰি পেৰামিটাৰাইজ কৰা হৈছিল।
ইয়াৰ পিছত LH1 উপ-ইউনিটটো নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। প্ৰথম অৱস্থাত PHENIX (49) ত স্বয়ংক্ৰিয় নিৰ্মাণ সঁজুলি ব্যৱহাৰ কৰি মেপ আৰু LH1-α আৰু LH1-β প্ৰটিন ক্ৰমক ইনপুট হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰি LH1 ক্ৰমৰ এটা অংশ স্বয়ংক্ৰিয়ভাৱে নিৰ্মাণ কৰা হৈছিল। আটাইতকৈ সম্পূৰ্ণ LH1 উপ-ইউনিট নিৰ্বাচন কৰক, ইয়াক নিষ্কাশন কৰক আৰু ইয়াক Coot ত লোড কৰক, ইয়াত অনুপস্থিত ক্ৰমটো হস্তচালিতভাৱে যোগ কৰক, আৰু দুটা BCl a (BCL) আৰু এটা spirilloxanthin (CRT) যোগ কৰাৰ আগতে সম্পূৰ্ণ গঠনটো হস্তচালিতভাৱে পৰিশোধন কৰক [প্ৰাসংগিক Rps অনুসৰি LH1 কমপ্লেক্সৰ ঘনত্ব আৰু জনা কেৰটিনয়ডৰ পৰিমাণ। প্ৰজাতি (১৭)]। সম্পূৰ্ণ LH1 উপ-ইউনিট কপি কৰক, আৰু LH1 ঘনত্বৰ কাষৰীয়া নন-মডেল অঞ্চলত ডক কৰিবলৈ UCSF চাইমেৰা “ডকিং মেপ সঁজুলি” ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু তাৰ পিছত ইয়াক Coot ত পৰিশোধন কৰক; সকলো LH1 উপ-ইউনিটৰ আৰ্হি প্ৰস্তুত নোহোৱালৈকে প্ৰক্ৰিয়াটো পুনৰাবৃত্তি কৰক। RC-LH114-W গঠনৰ বাবে, Coot ত আবণ্টিত নোহোৱা ঘনত্ব নিষ্কাশন কৰি, USCF Chimera মেপত বাকী অ-প্ৰটিন উপাদানসমূহৰ পৰা প্ৰটিনক বিভাজিত কৰা হয় আৰু Autobuild সঁজুলি প্ৰাৰম্ভিক মডেল স্থাপন কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়, আৰু বাকী উপ-ইউনিটসমূহ (প্ৰটিন-W) মডেলিং। PHENIX (৪৯)ত। Coot (48) ত ফলাফল মডেলত যিকোনো অনুপস্থিত ক্ৰম যোগ কৰক, আৰু তাৰ পিছত সম্পূৰ্ণ উপ-ইউনিটটো হস্তচালিতভাৱে পৰিশোধন কৰক। বাকী থকা অনাবণ্টিত ঘনত্ব লিপিডৰ সংমিশ্ৰণ (চিডিএল = চিডিএল, পিঅ’পিচি = ৬পিএল আৰু পিঅ’পিজি = পিজিটি), β-ডিডিএম ডিটাৰজেণ্ট (এলএমটি) আৰু ইউকিউ১০ অণুৰ (ইউ১০)ৰ সংমিশ্ৰণৰ লগত খাপ খায়। মডেল পৰিসংখ্যা আৰু ফিটৰ দৃশ্যমান মান আৰু উন্নত কৰিব নোৱাৰালৈকে সম্পূৰ্ণ প্ৰাৰম্ভিক মডেল নিখুঁত কৰিবলৈ Coot (48) ত PHENIX অনুকূলন (49) আৰু হাতৰ অনুকূলন ব্যৱহাৰ কৰক। শেষত, স্থানীয় মেপ চোকা কৰিবলে LocScale (50) ব্যৱহাৰ কৰক, আৰু তাৰ পিছত আবণ্টিত নোহোৱা ঘনত্ব আৰু স্বয়ংক্ৰিয় আৰু হস্তচালিত অনুকূলন আৰ্হি কৰাৰ অন্য কেইবাটাও চক্ৰ সম্পাদন কৰক।
নিজ নিজ ঘনত্বৰ ভিতৰত ডক কৰা নিজ নিজ পেপটাইড, কোফেক্টৰ আৰু অন্যান্য লিপিড আৰু কুইনন চিত্ৰ 1 আৰু 2 ত দেখুওৱা হৈছে। S18 ৰ পৰা S23 লৈ। চূড়ান্ত আৰ্হিৰ পৰিসংখ্যাগত তথ্য সূচী S1 ত দেখুওৱা হৈছে।
অন্যথা নিৰ্দিষ্ট নকৰালৈকে, UV/Vis/NIR শোষণ বৰ্ণালীসমূহ Cary60 স্পেকট্ৰ'ফ'ট'মিটাৰ (Agilent, USA)ত 250 nm ৰ পৰা 1000 nm লৈকে 1 nm ব্যৱধানত আৰু 0.1s সংহতি সময়ত সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল।
1 ৰ A880 লৈ 2 মিলিমিটাৰ পথৰ সৈতে কোৱাৰ্টছ কিউভেটত নমুনাটো পাতল কৰক, আৰু 400 আৰু 1000 nm ৰ ভিতৰত শোষণ বৰ্ণালী সংগ্ৰহ কৰক। বৃত্তাকাৰ ডাইক্ৰ’ইক বৰ্ণালীসমূহ জাস্কো ৮১০ স্পেকট্ৰ’প’লাৰিমিটাৰ (জাস্কো, জাপান)ত ৪০০ এন এম আৰু ৯৫০ এন এমৰ মাজৰ ১ এন এম ব্যৱধানত ২০ এন এম মিনিট-১ স্কেন হাৰত সংগ্ৰহ কৰা হৈছিল।
10μl আয়তন 990μl বান্ধনি বাফাৰ বা মিথানলত পাতল কৰি কোৰ কমপ্লেক্সক প্ৰায় 50 ৰ A880 লৈ পাতল কৰি মোলাৰ বিলুপ্তি সহগ নিৰ্ণয় কৰা হয়, আৰু BChl অৱক্ষয় কম কৰিবলৈ শোষণ বৰ্ণালী তৎক্ষণাত সংগ্ৰহ কৰা হয়। প্ৰতিটো মিথানলৰ নমুনাৰ BChl ৰ পৰিমাণ ৫৪.৮ মিলিমিটাৰ-১ চে.মি.-১ ৰ ৭৭১ এন এমত বিলুপ্তিৰ সহগ দ্বাৰা গণনা কৰা হৈছিল আৰু বিলুপ্তিৰ সহগ নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল (৫১)। জুখি উলিওৱা BChl ঘনত্বক ৩২ (RC-LH114-W) বা ৩৬ (RC-LH116) ৰে ভাগ কৰি মূল জটিল ঘনত্ব নিৰ্ণয় কৰা হয়, যিটো তাৰ পিছত বাফাৰ বিলুপ্তিৰ সহগত সংগ্ৰহ কৰা একেটা নমুনাৰ শোষণ বৰ্ণালী নিৰ্ণয় কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়। সমান্তৰাল। প্ৰতিটো নমুনাৰ বাবে তিনিটাকৈ বাৰে বাৰে জোখ লোৱা হৈছিল, আৰু গণনাৰ বাবে BChl Qy সৰ্বোচ্চৰ গড় শোষণ ক্ষমতা ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ৮৭৮ এন এমত জুখিলে আৰ চি-এল এইচ ১১৪-ডব্লিউৰ বিলুপ্তিৰ সহগ ৩২৮০±১৪০ মিলিমিটাৰ-১ চে.মি.-১, আনহাতে ৮৮০ এন এমত জুখিলে আৰ চি-এলএইচ১১৬ৰ বিলুপ্তিৰ সহগ ৩৮০০±৩০ মিলিমিটাৰ-১ চে.মি.-১।
(৫২) ত দিয়া পদ্ধতি অনুসৰি UQ10 ৰ পৰিমাণ নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল। মুঠতে এজিলেণ্ট ১২০০ এইচ পি এল চি ব্যৱস্থা ব্যৱহাৰ কৰি ৰিভাৰ্ছ ফেজ এইচ পি এল চি (আৰ পি-এইচ পি এল চি) কৰা হৈছিল। 0.02% (w/v) ফেৰিক ক্লৰাইড যুক্ত 50:50 মিথানল:ক্ল'ৰফৰ্মত প্ৰায় 0.02 nmol RC-LH116 বা RC-LH114-W দ্ৰৱীভূত কৰক, আৰু পূৰ্ব-সমতাযুক্ত বেকমেন কল্টৰ আল্ট্ৰাস্ফিয়াৰ ODS 4.6 mm HPLC ত 40°C ত 1 ml-1 মিনিট-1 ত দ্ৰৱীভূত কৰক ×২৫ চে.মি.ৰ স্তম্ভত দ্রাৱক (৮০:২০ মিথানল:২-প্ৰ’পেনল)। 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) আৰু 780 nm (BChl) ত 1 ঘণ্টাৰ বাবে শোষণ ক্ষমতা নিৰীক্ষণ কৰিবলৈ HPLC দ্রাৱকত আইছ’ক্ৰেটিক এলুচন সম্পন্ন কৰক। ২৫.৫ মিনিটত ২৭৫ এন এম ক্ৰমেট’গ্ৰামত থকা শিখৰটো একত্ৰিত কৰা হৈছিল, য’ত আন কোনো ধৰা পৰা যৌগ নাছিল। 0 ৰ পৰা 5.8 nmol লৈকে বিশুদ্ধ মানদণ্ডৰ ইনজেকচনৰ পৰা গণনা কৰা মানাংকন বক্ৰৰ ভিত্তিত নিষ্কাষিত UQ10 ৰ মোলাৰ পৰিমাণ গণনা কৰিবলৈ সংহত এলেকা ব্যৱহাৰ কৰা হয় (চিত্ৰ S14)। প্ৰতিটো নমুনা তিনিটা প্ৰতিলিপিত বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল, আৰু ৰিপৰ্ট কৰা ভুলটো গড়ৰ SD ৰ সৈতে মিল খায়।
0.1 সৰ্বোচ্চ Qy শোষণ থকা RC-LH1 কমপ্লেক্স যুক্ত দ্ৰৱ এটা 30 μM হ্ৰাস কৰা ঘোঁৰাৰ হৃদযন্ত্ৰৰ চাইট’ক্ৰ’ম c2 (Merck, UK) আৰু 0ৰ পৰা 50 μMUQ2 (Merck, UK)ৰ সৈতে প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল। প্ৰতিটো UQ2 ঘনত্বত তিনিটা ১-মিলিলিটাৰৰ নমুনা প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল আৰু জোখৰ পূৰ্বে আন্ধাৰৰ সৈতে সম্পূৰ্ণ খাপ খোৱাটো নিশ্চিত কৰিবলৈ ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত আন্ধাৰত ৰাতিটো ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। দ্ৰৱটো ৩০০ এন এম শিখা/৫০০ লাইন গ্ৰেটিং, ১.২৪ মিলিমিটাৰ ইনলেট, ০.১২ মিলিমিটাৰ মাজৰ আৰু ০.৬ মিলিমিটাৰ আউটলেট স্লিটৰ সৈতে সজ্জিত অ’লিছ আৰ এছ এম ১০০০ মডিউলাৰ স্পেকট্ৰ’ফ’ট’মিটাৰত ভৰোৱা হৈছিল। উত্তেজনা পোহৰ বাদ দিবলৈ নমুনা ফটোটিউব আৰু ৰেফাৰেন্স ফটোমাল্টিপ্লাইয়াৰ টিউবৰ প্ৰৱেশদ্বাৰত ৬০০ এন এম লং পাছ ফিল্টাৰ স্থাপন কৰা হয়। 0.15 ছেকেণ্ডৰ সংহতি সময়ৰ সৈতে 550 nm ত শোষণ ক্ষমতা নিৰীক্ষণ কৰা হৈছিল। 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) ৰ পৰা DC2200 নিয়ন্ত্ৰক (Thorlabs Ltd., UK) ৰ জৰিয়তে 90% তীব্ৰতাত ফাইবাৰ অপটিক কেবলৰ জৰিয়তে নিৰ্গত হয় আৰু পোহৰৰ উৎসলৈ 90° কোণত নিৰ্গত হয়। প্ৰথমে নমুনাটোৱে শোষণ নকৰা যিকোনো পোহৰ ঘূৰাই আনিবলৈ জোখৰ ৰশ্মিটো দাপোনৰ বিপৰীতে ৰখা হয়। ৫০ ছেকেণ্ডৰ আলোকসজ্জাৰ ১০ ছেকেণ্ড আগতে শোষণ ক্ষমতা নিৰীক্ষণ কৰক। তাৰ পিছত আন্ধাৰত ৬০ ছেকেণ্ডৰ বাবে শোষণ ক্ষমতা আৰু অধিক নিৰীক্ষণ কৰা হৈছিল যাতে কুইনোললে স্বতঃস্ফূৰ্তভাৱে চাইট’ক্ৰ’ম c23 + কিমান পৰিমাণে হ্ৰাস কৰে সেইটো মূল্যায়ন কৰা হয় (কেঁচা তথ্যৰ বাবে চিত্ৰ S8 চাওক)।
তথ্যসমূহ ০.৫ৰ পৰা ১০ ছেকেণ্ডৰ ভিতৰত ৰৈখিক প্ৰাৰম্ভিক হাৰ ফিট কৰি (UQ2 ঘনত্বৰ ওপৰত নিৰ্ভৰ কৰি) আৰু প্ৰতিটো UQ2 ঘনত্বত তিনিওটা নমুনাৰ হাৰ গড় কৰি প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰা হৈছিল। নিজ নিজ বিলুপ্তি সহগ দ্বাৰা গণনা কৰা RC-LH1 ঘনত্ব ব্যৱহাৰ কৰি হাৰক অনুঘটকীয় কাৰ্যক্ষমতালৈ ৰূপান্তৰ কৰা হৈছিল, Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) ত প্লট কৰা হৈছিল, আৰু মাইকেলিছ-মেণ্টেন মডেলত ফিট কৰি আপাত Km আৰু Kcat মান নিৰ্ণয় কৰা হৈছিল।
ক্ষণস্থায়ী শোষণ জোখৰ বাবে RC-LH1 নমুনাটো ৫০ মিলিমিটাৰ ছডিয়াম এস্কৰবেট (মাৰ্ক, আমেৰিকা) আৰু ০.৪ মিলিমিটাৰ টাৰ্বুটিন (মাৰ্ক, আমেৰিকা) যুক্ত আইএমএচি বাফাৰত ~২μM লৈ পাতল কৰা হৈছিল। এস্কৰবিক এচিডক বলিদানমূলক ইলেক্ট্ৰন দাতা হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হয়, আৰু টাৰ্ট-বুটাক্লফেনক কিউবি প্ৰতিৰোধক হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰা হয় যাতে সমগ্ৰ জোখ-মাখৰ প্ৰক্ৰিয়াটোত মূল আৰ চি দাতাটো হ্ৰাস হৈ থাকে (অৰ্থাৎ ফটোঅক্সিডাইজ নহয়)। লেজাৰ পথত থকা নমুনাটোৱে উত্তেজনা পালছৰ মাজত আন্ধাৰ অভিযোজনৰ বাবে যথেষ্ট সময় থকাটো নিশ্চিত কৰিবলৈ ২ মিলিমিটাৰ অপটিকেল পথৰ দৈৰ্ঘ্যৰ এটা কাষ্টম ঘূৰ্ণন কোষত (প্ৰায় ০.১ মিটাৰ ব্যাসৰ, ৩৫০ আৰ পি এম) প্ৰায় ৩ মিলিলিটাৰ নমুনা যোগ কৰা হয়। Ti: Sapphire লেজাৰ ব্যৱস্থা (Spectra Physics, USA) বৃদ্ধি কৰিবলৈ ~100-fs লেজাৰ পালছ ব্যৱহাৰ কৰি নমুনাটোক 880 nm ত 1 kHz (NIR ৰ বাবে 20 nJ বা Vis ৰ বাবে 100 nJ) পুনৰাবৃত্তি হাৰত উত্তেজিত কৰক। তথ্য সংগ্ৰহ কৰাৰ আগতে নমুনাটো প্ৰায় ৩০ মিনিটৰ বাবে উত্তেজনা পোহৰৰ সন্মুখীন হ’ব লাগে। সংস্পৰ্শলৈ আহিলে QA নিষ্ক্ৰিয় হৈ পৰিব (সম্ভৱতঃ QA এবাৰ বা দুবাৰ হ্ৰাস কৰিব)। কিন্তু অনুগ্ৰহ কৰি মন কৰক যে এই প্ৰক্ৰিয়াটো উলটিব পৰা যায় কাৰণ দীৰ্ঘ সময়ৰ বাবে অন্ধকাৰ অভিযোজনৰ পিছত আৰ চি লাহে লাহে QA কাৰ্য্যকলাপলৈ ঘূৰি আহিব। -১০ৰ পৰা ৭০০০ পি এছৰ বিলম্ব সময়ৰ সৈতে ক্ষণস্থায়ী বৰ্ণালী জুখিবলৈ হেলিঅ'ছ বৰ্ণালীমাপক (আল্ট্ৰাফাষ্ট চিষ্টেমছ, আমেৰিকা) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ডাটা ছেটসমূহ আনগ্ৰুপ কৰিবলে, তাৰ পিছত একত্ৰিত আৰু প্ৰামাণিককৰণ কৰিবলে Surface Xplorer চফ্টৱেৰ (Ultrafast Systems, USA) ব্যৱহাৰ কৰক। ক্ষয়ৰ সৈতে জড়িত ভিন্নতামূলক বৰ্ণালী লাভ কৰিবলৈ সংযুক্ত তথ্যৰ গোট ব্যৱহাৰ কৰিবলৈ CarpetView চফ্টৱেৰ পেকেজ (Light Conversion Ltd., Lithuania) ব্যৱহাৰ কৰক, বা Origin (OriginLab, USA) ত একক-তৰংগদৈৰ্ঘ্যৰ বৰ্ণালী বিৱৰ্তনক ফিট কৰিবলৈ যন্ত্ৰৰ সঁহাৰিৰ সৈতে একাধিক ঘাতক কনভলভ কৰা এটা ফলন ব্যৱহাৰ কৰক।
ওপৰত উল্লেখ কৰা অনুসৰি (৫৩) আৰ চি আৰু পেৰিফেৰেল এল এইচ ২ এন্টেনা দুয়োটাৰে অভাৱত এল এইচ ১ কমপ্লেক্স যুক্ত এটা সালোক সংশ্লেষণ ফিল্ম প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল। মেমব্ৰেনখন ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ (পিএইচ ৮.০)ত পাতল কৰা হৈছিল আৰু তাৰ পিছত ২ মিলিমিটাৰ অপটিকেল পথৰ সৈতে কোৱাৰ্টছ কিউভেটত ভৰোৱা হৈছিল। -১০ৰ পৰা ৭০০০ পি এছৰ বিলম্ব সময়ৰ সৈতে ৫৪০ এন এমত নমুনাটোক উত্তেজিত কৰিবলৈ ৩০এনজে লেজাৰ পালছ ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। Rps ৰ বাবে বৰ্ণনা কৰা ধৰণে ডাটা ছেট প্ৰক্ৰিয়া কৰক। pal নমুনা।
৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ২ ঘণ্টা ধৰি ১৫০,০০০ আৰ চি এফত কেন্দ্ৰচালিত কৰি মেমব্ৰেনটো পেলেট কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত ৮৮০ এন এমত ইয়াৰ শোষণ ক্ষমতা ২০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচ চি এল (পি এইচ ৮.০) আৰু ২০০ মিলিমিটাৰ NaCl ত পুনৰ স্থলবন্দী কৰা হৈছিল। ২% (w/v) β-DDM ত ৪ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত আন্ধাৰত ১ ঘণ্টা লাহে লাহে লৰাই মেমব্ৰেনখন দ্ৰৱীভূত কৰক। নমুনাটো ১০০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইইথাইলএমোনিয়াম কাৰ্বনেট (পিএইচ ৮.০) (TEAB; মাৰ্ক, ইউ কে)ত ২.৫ মিলিগ্ৰাম মিলিলিটাৰ-১ (বায়’-ৰেড বিশ্লেষণ) প্ৰটিনৰ ঘনত্বলৈ পাতল কৰা হৈছিল। পূৰ্বে প্ৰকাশিত পদ্ধতিৰ পৰা (৫৪) অধিক প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰা হৈছিল, ৫০ μg প্ৰটিনক ১% (w/v) ছডিয়াম ল’ৰেট (Merck, UK) যুক্ত মুঠ ৫০ μl TEAB ত পাতল কৰাৰ পৰা আৰম্ভ কৰি। 60 s জন্য sonication পিছত, এটা 5 মিলিমিটাৰ tris (2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) 37 ° C 30 মিনিটৰ বাবে হ্ৰাস কৰা হৈছিল. S-এলকাইলেচনৰ বাবে নমুনাটো ১০ মিলিমিটাৰ মিথাইল এছ-মিথাইলথাইঅ’মিথেনছালফনেট (মাৰ্ক, ইউ কে)ৰ সৈতে ইনকিউবেট কৰি ২০০ মিলিমিটাৰ আইছ’প্ৰ’পেনল ষ্টক দ্ৰৱৰ পৰা কোঠাৰ উষ্ণতাত ১০ মিনিটৰ বাবে যোগ কৰক। ২ μg ট্ৰিপচিন/এণ্ডোপ্ৰটিনেজ Lys-C মিশ্ৰণ (Promega UK) যোগ কৰি প্ৰটিঅ’লাইটিক পাচন কৰা হৈছিল আৰু ৩৭ ডিগ্ৰী চেলছিয়াছত ৩ ঘণ্টা ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। ৫০ μl ইথাইল এচিটেট আৰু ১০ μl ১০% (v/v) এল চি গ্ৰেড ট্ৰাইফ্ল’ৰ’এচিটিক এচিড (TFA; থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ইউ কে) যোগ কৰি ৬০ ছেকেণ্ডৰ বাবে ভৰটেক্স কৰি ল’ৰেট ছাৰফেক্টেণ্ট নিষ্কাশন কৰা হৈছিল। ১৫,৭০০ আৰ চি এফত ৫ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰি পৰ্যায় পৃথকীকৰণক প্ৰসাৰিত কৰা হৈছিল। প্ৰস্তুতকাৰকৰ প্ৰট’কল অনুসৰি পেপটাইড থকা তলৰ পৰ্যায়টো সাৱধানে এস্পিৰেট কৰি নিমখমুক্ত কৰিবলৈ C18 স্পিন কলাম (Thermo Fisher Scientific, UK) ব্যৱহাৰ কৰা হৈছিল। ভেকুৱাম কেন্দ্ৰচালিত কৰি শুকুৱাই লোৱাৰ পিছত নমুনাটো ০.৫% টিএফএ আৰু ৩% এচিট’নাইট্ৰাইলত দ্ৰৱীভূত কৰা হয় আৰু পূৰ্বে বিশদভাৱে উল্লেখ কৰা ব্যৱস্থাৰ পৰিমাপসমূহ ব্যৱহাৰ কৰি গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ সৈতে সংযুক্ত নেন’ফ্ল’ আৰ পি ক্ৰ’মাট’গ্ৰাফীৰ দ্বাৰা ৫০০ এনজি বিশ্লেষণ কৰা হয়।
Rps সন্ধান কৰিবলৈ প্ৰটিন চিনাক্তকৰণ আৰু পৰিমাণ নিৰ্ণয়ৰ বাবে MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ব্যৱহাৰ কৰক। পালুষ্ট্ৰিছ প্ৰটিঅ'ম ডাটাবেছ (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)। গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ প্ৰটিঅ'মিক্সৰ তথ্যসমূহ ডাটাছেট চিনাক্তকৰ্তা PXD020402 ৰ অধীনত PRIDE অংশীদাৰ ভঁৰাল (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ৰ জৰিয়তে ProteomeXchange Alliance ত জমা কৰা হৈছে।
ইলেক্ট্ৰ’স্প্ৰে আয়নীয়কৰণ গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞানৰ সৈতে সংযুক্ত আৰপিএলচিৰ দ্বাৰা বিশ্লেষণৰ বাবে বন্য-প্ৰকাৰৰ আৰপিএছৰ পৰা আৰচি-এলএইচ১ কমপ্লেক্স প্ৰস্তুত কৰা হৈছিল। পূৰ্বে প্ৰকাশিত পদ্ধতি (১৬) ব্যৱহাৰ কৰি, palustris কোষত উৎপাদিত প্ৰটিনৰ ঘনত্ব ২০ মিলিমিটাৰ Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl আৰু 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad বিশ্লেষণ) ) DDM ত 2 mg ml-1 আছিল। প্ৰস্তুতকাৰকৰ প্ৰট’কল অনুসৰি ২ডি বিশুদ্ধকৰণ কিট (জিই হেল্থকেয়াৰ, আমেৰিকা) ব্যৱহাৰ কৰি বৃষ্টিপাত পদ্ধতিৰে ১০ মাইক্ৰ’গ্ৰাম প্ৰ’টিন উলিয়াব পাৰি, আৰু বৰষুণখিনি ২০ μl ৬০% (v / v) ফৰ্মিক এচিড (FA), ২০% (v / v) এচিট’নাইট্ৰাইল আৰু ২০% (v/v) পানীত দ্ৰৱীভূত কৰিব লাগে। পাঁচটা মাইক্ৰ’লিটাৰক গণ বৰ্ণালীবিজ্ঞান (মেক্সিছ ইউ এইচ আৰ-টি অ’ এফ, ব্ৰুকাৰ)ৰ সৈতে সংযুক্ত আৰ পি এল চি (ডাইঅ’নেক্স আৰ এছ এল চি)ৰ দ্বাৰা বিশ্লেষণ কৰা হৈছিল। ৬০°C আৰু ১০০μlmin -1 ত পৃথক কৰাৰ বাবে MabPac ১.২×১০০ মিলিমিটাৰ স্তম্ভ (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ইউ কে) ব্যৱহাৰ কৰক, ৮৫% (v / v) দ্রাৱক A [০.১% (v / v) FA আৰু ০.০২% (V/v) TFA জলীয় দ্ৰৱ]ৰ পৰা ৮৫%(v/v) দ্রাৱক B ৰ গ্ৰেডিয়েণ্টৰ সৈতে [90%(v/v) FA আৰু 90%(v/v) এচিট'নাইট্ৰাইল TFA ত 0.02%(v/v)] প্ৰামাণিক ইলেক্ট্ৰ'স্প্ৰে আয়নীয়কৰণ উৎস আৰু অবিকল্পিত প্ৰাচলসমূহ 60 মিনিটতকৈ অধিক সময়ৰ বাবে ব্যৱহাৰ কৰি, গণ বৰ্ণালীমাপকে 100ৰ পৰা 2750 m/z (ভৰ-আধান অনুপাত) লাভ কৰে। ExPASy জৈৱ তথ্যবিজ্ঞান সম্পদ পৰ্টেল FindPept সঁজুলি (https://web.expasy.org/findpept/)ৰ সহায়ত, গণ বৰ্ণালীক জটিলৰ উপ-ইউনিটসমূহৰ সৈতে মেপ কৰক।
কোষবোৰক ১০০ মিলিলিটাৰ এন এফ-কম (১০μMm-2 s-1), মধ্যমীয়া (৩০μMm-2 s-1) বা উচ্চ (৩০০μMm-2 s-1) পোহৰত ৭২ ঘণ্টা ধৰি ডাঙৰ কৰা হৈছিল। M22 মাধ্যম (M22 মাধ্যম য'ত এমোনিয়াম ছালফেট বাদ দিয়া হয় আৰু ছডিয়াম ছাক্সিনেটৰ ঠাইত ছডিয়াম এচিটেট লোৱা হয়) ১০০ মিলিলিটাৰ স্ক্ৰু-টপ বটলত (২৩)। পাঁচটা ৩০ ছেকেণ্ডৰ চক্ৰত ০.১ মাইক্ৰন কাঁচৰ গুটি ১:১ আয়তন অনুপাতত বিড কৰি কোষবোৰ লাইজ কৰা হৈছিল আৰু বৰফত ৫ মিনিট ঠাণ্ডা কৰা হৈছিল। অদ্ৰৱণীয় পদাৰ্থ, অভঙা কোষ আৰু কাঁচৰ গুটিবোৰ বেঞ্চটপ মাইক্ৰ’চেণ্ট্ৰিফিউজত ১৬,০০০ আৰ চি এফত ১০ মিনিটৰ বাবে কেন্দ্ৰচালিত কৰি আঁতৰাই পেলোৱা হৈছিল। 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ত 100,000 RCF ৰ সৈতে Ti 70.1 ৰ’টাৰত 40/15% (w/w) চুক্ৰ’জ গ্ৰেডিয়েণ্টৰ সৈতে 10 ঘণ্টা ধৰি পৃথক কৰা হৈছিল।
আমাৰ পূৰ্বৰ কামত বৰ্ণনা কৰা অনুসৰি, PufW (16) ৰ ওপৰত His টেগৰ ইমিউন’ডিটেকচন। মুঠতে, বিশুদ্ধ কোৰ কমপ্লেক্স (11.8 nM) বা RC ৰ একে ঘনত্ব থকা মেমব্ৰেন (হ্ৰাস পোৱা পাৰ্থক্য বৰ্ণালী বিয়োগ কৰি অক্সিডেচনৰ দ্বাৰা নিৰ্ধাৰিত আৰু ৰং কৰা জেলৰ ওপৰত লোড মিলাই) 2x SDS লোডিং বাফাৰ (Merck, UK)ত দুবাৰকৈ পাতল কৰা হয়। প্ৰটিনবোৰক প্ৰতিৰূপ ১২% বিচ-ট্ৰিছ নুপেজ জেল (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ইউ কে)ত পৃথক কৰা হৈছিল। আৰ চি-এল উপ-ইউনিটটো লোড আৰু দৃশ্যমান কৰিবলৈ এটা জেলক কুমাচি ব্রিলিয়েণ্ট ব্লু (বায়’-ৰেড, ইউ কে) ৰে ৰং কৰা হৈছিল। দ্বিতীয় জেলত থকা প্ৰটিনটো ইমিউন’এছেইৰ ​​বাবে মিথানল-এক্টিভেটেড পলিভিনাইলডিন ফ্ল’ৰাইড (PVDF) মেমব্ৰেন (থাৰ্মো ফিচাৰ চাইন্টিফিক, ইউ কে)লৈ স্থানান্তৰ কৰা হৈছিল। পিভিডিএফ মেমব্ৰেনক ৫০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৭.৬), ১৫০ মিলিমিটাৰ নেচিএল, ০.২% (v / v) টুইন-২০ আৰু ৫% (w / v) স্কিমড গাখীৰৰ গুড়িত ব্লক কৰা হৈছিল, আৰু তাৰ পিছত এণ্টি-হিছ প্ৰাথমিক এন্টিব’ডিৰ সৈতে ইনকিউবেট কৰা হৈছিল (এন্টিব’ডি বাফাৰ পাতল কৰক [৫০ মিলিমিটাৰ ট্ৰাইছ-এইচচিএল (পিএইচ ৭.৬)ত), ইনকিউবেট কৰা হৈছিল। ১৫০ মিলিমিটাৰ NaCl আৰু ০.০৫% (v/v) Tween-20] ১:১০০০ A190-114A, বেথাইল লেবৰেটৰীজ, আমেৰিকা)ত ৪ ঘণ্টা ৰাখিব লাগে। এন্টিবডি বাফাৰত ৫ মিনিটৰ বাবে ৩ বাৰ ধুই পেলোৱাৰ পিছত মেমব্ৰেনটোক হৰ্চেৰেডিচ পেৰাক্সিডেজ (চিগমা-এলড্ৰিচ, ইউ কে) এণ্টি-মাউছ ছেকেণ্ডাৰী এন্টিব’ডি (এন্টিব’ডি বাফাৰত ১:১০,০০০ পাতল কৰা)ৰ সৈতে সংযুক্ত কৰা হৈছিল, যাতে WESTAR ETA C ২.০ কেমিলুমিনচেন্স ছাবষ্ট্ৰেট ব্যৱহাৰ কৰি ধৰা পেলাব পৰা যায় (এন্টিব’ডি বাফাৰত ৩ বাৰ ধোৱাৰ পিছত) (চায়ানাজেন, ইটালী) আৰু আমেৰশ্বাম ইমেজাৰ ৬০০ (জিই হেল্থকেয়াৰ, ইউ কে)।
প্ৰতিটো ৰং কৰা জেল বা ইমিউন'এছেই লেনৰ তীব্ৰতা বিতৰণ অংকন কৰি, শিখৰৰ তলৰ অঞ্চলটো একত্ৰিত কৰি আৰু RC-L (ৰঙীন জেল) আৰু প্ৰটিন-ডব্লিউ (ইমিউন'এছেই)ৰ তীব্ৰতাৰ অনুপাত গণনা কৰি, ইমেজজে (৫৭) ছবিখন প্ৰক্ৰিয়াকৰণ কৰক। এই অনুপাতসমূহক বিশুদ্ধ আৰ চি-এলএইচ১১৪-ডব্লিউ নমুনাত আৰ চি-এল আৰু প্ৰটিন-ডব্লিউৰ অনুপাত ১:১ বুলি ধৰি লৈ আৰু সেই অনুসৰি সমগ্ৰ তথ্যৰ গোটটো স্বাভাৱিক কৰি মোলাৰ অনুপাতলৈ ৰূপান্তৰ কৰা হৈছিল।
এই প্ৰবন্ধটোৰ বাবে পৰিপূৰক সামগ্ৰীৰ বাবে অনুগ্ৰহ কৰি http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 চাওক
এইটো ক্ৰিয়েটিভ কমন্স এট্ৰিবিউচন লাইচেন্সৰ চৰ্তসমূহৰ অধীনত বিতৰণ কৰা এটা মুক্ত প্ৰৱেশ প্ৰবন্ধ। প্ৰবন্ধটোৱে যিকোনো মাধ্যমত নিষিদ্ধ ব্যৱহাৰ, বিতৰণ আৰু পুনৰুত্পাদনৰ অনুমতি দিয়ে এই চৰ্তত যে মূল কামটো সঠিকভাৱে উদ্ধৃত কৰা হৈছে।
টোকা: আমি আপোনাক কেৱল আপোনাৰ ইমেইল ঠিকনা দিবলৈ কওঁ যাতে আপুনি পৃষ্ঠালৈ পৰামৰ্শ দিয়া ব্যক্তিজনে জানে যে আপুনি তেওঁলোকে ইমেইলটো চাব বিচাৰে আৰু ই স্পেম নহয়। আমি কোনো ইমেইল ঠিকনা ধৰিব নোৱাৰো।
এই প্ৰশ্নটো আপুনি দৰ্শক নেকি পৰীক্ষা কৰিবলৈ আৰু স্বয়ংক্ৰিয় স্পেম জমা দিয়া ৰোধ কৰিবলৈ ব্যৱহাৰ কৰা হয়।
ডেভিড জে কে শ্বেইনছবেৰী, পাৰ্ক কিয়ান, ফিলিপ জে জেকচন, কেটলিন এম ফেৰিছ, ডাৰিয়াছ এম নিডজৱিড্জকি, এলিজাবেথ চি মাৰ্টিন, ডেভিড এ ফাৰ্মাৰ, লৰ্না এ মেলন, ৰেবেকা এফ থম্পছন, নীল এ ৰেনছন, ডেনিয়েল পি কেনিফ , মাৰ্ক জে ডিকমেন, ডিউই হোল্টেন, ক্ৰীষ্টিন কিৰমাইয়াৰ, এণ্ড্ৰু হিচকক, চি নীল হাণ্টাৰ
বিক্ৰিয়া কেন্দ্ৰত থকা পোহৰৰ ফান্দ ১ কমপ্লেক্সৰ উচ্চ ৰিজ’লিউচনৰ গঠনে কুইনন গতিবিদ্যাৰ নতুন অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে।
ডেভিড জে কে শ্বেইনছবেৰী, পাৰ্ক কিয়ান, ফিলিপ জে জেকচন, কেটলিন এম ফেৰিছ, ডাৰিয়াছ এম নিডজৱিড্জকি, এলিজাবেথ চি মাৰ্টিন, ডেভিড এ ফাৰ্মাৰ, লৰ্না এ মেলন, ৰেবেকা এফ থম্পছন, নীল এ ৰেনছন, ডেনিয়েল পি কেনিফ , মাৰ্ক জে ডিকমেন, ডিউই হোল্টেন, ক্ৰীষ্টিন কিৰমাইয়াৰ, এণ্ড্ৰু হিচকক, চি নীল হাণ্টাৰ
বিক্ৰিয়া কেন্দ্ৰত থকা পোহৰৰ ফান্দ ১ কমপ্লেক্সৰ উচ্চ ৰিজ’লিউচনৰ গঠনে কুইনন গতিবিদ্যাৰ নতুন অন্তৰ্দৃষ্টি প্ৰদান কৰে।
©২০২১ আমেৰিকান এছ’চিয়েচন ফৰ দ্য এডভান্সমেণ্ট অৱ চাইন্স। সকলো অধিকাৰ সংৰক্ষিত। AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef আৰু COUNTER ৰ অংশীদাৰ। চাইন্সএডভান্সছ আই এছ এছ এন ২৩৭৫-২৫৪৮।